一種檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法技術

本發明專利技術公開了一種檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法。本發明專利技術提供的方法，包括如下步驟：(1)植物根系片段的固定；(2)熒光原位雜交；其特征在于：所述步驟(1)和所述步驟(2)之間還包括如下步驟甲：將完成步驟(1)的植物根系片段用0.0001至0.1mol/L焦磷酸四鈉水溶液進行處理。本發明專利技術的發明專利技術人發現焦磷酸四鈉水溶液可達到使植物根系與表面微生物發生解離的現象。在此基礎上，對現有FISH方法進行改進，在現有FISH方法的固定與熒光原位雜交兩個步驟之間，增加了焦磷酸四鈉水溶液處理的步驟。本發明專利技術解決了植物根系FISH觀測中植物本身常發生的自發熒光現象和根系本身附著根際微生物含量較小不便于觀測的難點問題。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及。
技術介紹
根際微生物(rhizosphere microbe)是在植物根系直接影響的土壤范圍內生長繁殖的微生物，其種類有細菌、放線菌、真菌、藻類和原生動物等，一般數量比根際外多幾倍至幾十倍。它們和植物間是互生關系，與植物根系相互作用、相互促進。根據植物根系與根際微生物共存形式又分為多種形式，最常見的如豆科植物與相應的根瘤細菌、外生菌根、內生菌根以及病原菌復合體等。近年來，隨著宏基因組學與分子生態技術迅速發展，微生物熒光原位雜交 (fluore·scence in situ hybridization,FISH)結合的顯微鏡觀測成為了解根際微生物的有力工具。熒光原位雜交是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術。它以熒光染料標記的16S rDNA和16S rRNA寡核苷酸序列作為探針，按照兩個核酸的堿基序列互補原則，將熒光素標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上(也可使用生物素標記的探針，再加入標記有熒光素的生物素單抗)，通過熒光檢測系統和圖形分析技術對染色體或DNA纖維上的DNA序列進行定位、定性和相對定量分析，實現原位樣品中的目標細菌的探測。熒光原位雜交技術已經開始應用于植物根際微生物的觀察，但是目前普遍存在一些難點問題，主要集中在兩個方面。第一個方面也是最大的一個難點是植物根系本身通常具有較強的自發熒光。植物樣本采集后的最初24小時之內是觀測的最佳時機，之后由于植物本身逐漸加強的自發熒光現象嚴重干擾了微生物的觀測，但現實操作中很難保證采集植物樣本后能夠及時進行檢測。第二個方面是根際微生物稀疏的分布使得顯微鏡觀測過程中難以尋找到目的微生物，并且隨著時間的推移，根系本身逐漸加強的自發熒光現象使觀測更加困難。這兩個難點為植物根際微生物FISH觀測的瓶頸。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供。本專利技術提供的用于檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法，包括如下步驟(I)植物根系片段的固定；(2)熒光原位雜交；其特征在于所述步驟(I)和所述步驟(2)之間還包括如下步驟甲將完成步驟 (I)的植物根系片段用O. 0001至O. lmol/L焦磷酸四鈉水溶液進行處理，然后棄去所述植物根系片段。所述步驟甲中的處理條件可為20-30°C、15-60分鐘。所述步驟甲中的處理條件具體可為22°C、20分鐘。所述步驟甲中，所述焦磷酸四鈉水溶液的濃度具體可為0. OOlmol/ L0所述方法還可包括如下步驟乙將完成所述步驟甲的溶液體系(反應習題)離心收集沉淀，用PBS緩沖液沖洗并懸浮。所述PBS緩沖液具體可為pH = 7. 4、IOmmol的PBS 緩沖液。每株植物的根系片段完成所述步驟甲的溶液體系得到的沉淀優選采用2-5ml所述 PBS緩沖液進行所述懸浮。所述兩步驟乙中的所述離心的條件具體可為16000g，30秒。所述步驟(I)具體可為將所述植物根系片段浸泡于溶液甲中12小時；所述溶液甲是將3體積份固定液和I體積份3XPBS緩沖液混合得到的；所述固定液的pH為7.0-7. 4，含有4g/100ml多聚甲醛。所述固定液的配制方法具體如下(以IOOml體積為例) (I)取66ml超純水在水浴中加熱至600C ； (2)加入4g多聚甲醛；(3)加入2mol/L的NaOH 水溶液至多聚甲醛充分溶解；⑷用3XPBS緩沖液補足至IOOml ； (5)室溫下放置冷卻，用 lmol/L的HCl水溶液調節pH至7. 0-7. 4; (6)用注射器通過濾頭(O. 22 μ m)過濾。所述 3XPBS緩沖液具體可為pH = 7. 4、30mmol的PBS緩沖液。所述突光原位雜交的條件具體可為46°C雜交1. 5小時。所述熒光原位雜交所用的探針上具有熒光素標記。所述熒光素具體可為FLUOS熒光素。所述熒光原位雜交所用的探針的核苷酸序列具體可如序列表的序列I所示。所述熒光素可位于所述探針的5’端或3’端。在所述熒光原位雜交中，所述探針的濃度優選為8.3pmol/ μ I或5pmol/μ I。所述植物根際微生物具體可為真細菌。所述植物具體可為燈芯草(Juncus acutiflorus)。本專利技術提供的方法具體可包括如下步驟①將植物的根系組織切割成1. 5-2. 5cm(2cm左右)長度的根系片段；②將所述根系片段浸泡于所述溶液甲(以足夠將所述根系片段完全淹沒為準，2-5ml均可)中進行10-15小時(如12小時)的固定；③將步驟②的反應體系離心(具體可為16000g，30秒)收集沉淀并用所述PBS 緩沖液沖洗兩次，然后用所述焦磷酸四鈉水溶液(以足夠將所述根系片段完全淹沒為準，5-10ml均可)懸浮，在22°C水浴中培養20分鐘(為使作用完全每5分鐘漩渦振蕩一次，每次振蕩約10-20秒);④將步驟③的反應體系中的植物根系取出后離心(如16000g，30秒)收集沉淀并用所述PBS緩沖液沖洗兩次，然后用所述PBS緩沖液(以足夠將所述根系片段完全淹沒為準,2-5ml均可)懸浮；⑤將10 μ I步驟④得到的懸浮液滴加至載玻片上，使其干燥(可用氮氣吹干，也可在空氣中自然風干)；⑥將步驟⑤得到的載玻片依次在50%乙醇水溶液、80%乙醇水溶液和100%乙醇浸泡3分鐘；⑦將10μ I雜交緩沖液滴至載玻片的樣品上，加入1μ I所述探針并與雜交緩沖液混合均勻，46°C雜交1. 5小時；⑧用淋洗緩沖液沖洗掉載玻片上的雜交緩沖液，然后將載玻片浸泡于所述淋洗緩沖液中，48°C水浴靜置20分鐘；用蒸餾水沖洗后使其干燥(可放置于46°C烘箱中進行干燥，也可利用氣體吹干)；⑨進行DAPI染色后用熒光顯微鏡觀察。所述雜交緩沖液的制備方法具體可為將180 μ I 5Μ NaCl水溶液、300微升的甲酰胺、2 μ I 10g/100ml SDS水溶液依次加入并混勻，并用milliQ超純水定容至I毫升。所述雜交緩沖液由水和如下濃度的各個溶質組成=NaCl O. 9M、SDS O. 02g/100ml、甲酰胺30% (體積比)。所述淋洗緩沖液的制備方法具體可為將Iml Tris-HCl緩沖液(1M、pH = 8. O)、 1020 μ I 5Μ NaCl 水溶液、500 μ I O. 5Μ EDTA 水溶液(pH = 8. O)混勻，并用 milliQ 超純水補足至50ml。所述淋洗緩沖液由水和如下濃度的各個溶質組成=Tris-HCl O. 02M、NaCl O. 102Μ、0· 005Μ EDTA0所述DAPI染色時,可以加入抗粹滅劑。所述抗淬滅劑具體可為Vectorshield。本專利技術提供的方法可以對采集后的樣本進行即時檢測，也可以允許采集后將樣本放置保存一定時間后再進行檢測，特別是對于放置24小時以上的樣本，避免了自發熒光， 具有突出良好的效果。本專利技術的專利技術人經過長期的實驗研究，發現焦磷酸四鈉水溶液可達到使植物根系與表面微生物發生解離的現象。在此基礎上，對現有FISH方法進行改進，在現有FISH方法的固定與熒光原位雜交兩個步驟之間，增加了焦磷酸四鈉水溶液處理的步驟。本專利技術中的技術方案為將簡單清洗去除土壤及沉積物顆粒之后的植物根系片段進行固定；用焦磷酸四鈉水溶液處理固定之后的樣品，通過焦磷酸四鈉對根際微生物與其附著物本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于檢測植物根際微生物的熒光原位雜交方法，包括如下步驟：(1)植物根系片段的固定；(2)熒光原位雜交；其特征在于：所述步驟(1)和所述步驟(2)之間還包括如下步驟甲：將完成步驟(1)的植物根系片段用0.0001至0.1mol/L焦磷酸四鈉水溶液進行處理，然后棄去所述植物根系片段。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：祝貴兵，王雨，尹澄清，
申請(專利權)人：中國科學院生態環境研究中心，
類型：發明
國別省市：