一種從水稻種子生產和分離純化重組人抗胰蛋白酶（OsrAAT)的方法技術

本發明專利技術提供了一種水稻遺傳密碼子優化的OsrAAT基因，相關載體及其制備OsrAAT轉基因水稻種子的方法和OsrAAT的分離純化方法。通過水稻胚乳細胞特異性表達OsrAAT的表達載體來制備OsrAAT轉基因水稻種子，并從中分離純化OsrAAT，所獲得OsrAAT的HPLC純度為97％，收率可達18.89±3.19％，相當于每公斤的粗米可生產0.366g的OsrAAT。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于基因工程
，具體涉及一種水稻遺傳密碼子優化的OsrAAT基因、相關載體及其從轉基因水稻種子生產、分離和純化OsrAAT的方法。
技術介紹
·人α1-抗胰蛋白酶(AAT)，也稱為人α 1_蛋白酶抑制劑(α 1-ΡΙ)，是人外周血中最富含絲氨酸的蛋白酶抑制劑。其主要是在肝臟中合成，并在肺中抑制中性粒細胞彈性蛋白酶(Blank、Brantly，1994)。AAT缺乏癥是一種與肺氣腫和肝臟疾病相關的遺傳性疾病(Eriksson, 1996)。靜脈注射增加源自血衆的人α1-抗胰蛋白酶(plasma-derived AAT,pAAT)是治療AAT缺乏癥病人唯一可行的臨床治療方法(Heresi和Stoller，2008)。此外，AAT還有許多的治療用途，如在預防小鼠I型糖尿病、治療皮膚病(Lewis，Shapiro等，2005 ；Brown, 2006)，并在先天免疫系統中發揮著重要的抗炎作用(許、戴等，2001)。目前，商業化生產的pAAT主要是來自人血漿，其產量受到血液供應的限制，而且人源PAAT具有傳播新的或未知病原體的風險，因此確保其安全性顯得非常復雜(Karnaukhova,Ophir等,2006)。除此之外，為了滿足市場需求,生產重組al_抗胰蛋白酶(rAAT)并具有成本效益的替代方法也不斷被開發出來。1983年，大腸桿菌首先被用于生產無活性的rAAT (Bollen等，1983)。之后用大腸桿菌表達系統表過rAAT的最高水平可達到38mg/L(Karnaukhova等,2004)。但是，由于大腸桿菌表達系統缺乏轉錄后的修飾作用，其表達的rAAT也只能用于實驗室研究。作為真核表達系統的酵母可以進行高甘露糖類型的聚糖修飾作用(Cregg, Cereghino等,2000),但這種修飾與人聚糖結構不同。缺失和異常的糖基修飾是妨礙酵母表達系統表達重組多糖蛋白的主要問題。盡管通過分批補料培養酵母來大規模生產rAAT的收率高達到1. 23g/L (Tamer和Chisti，2001)，然而，藥代動力學研究表明，酵母生產的rAAT會被迅速地從血液中清除(Casolaro，Fells等，1987)。也有研究用黑曲霉表達rAAT，因為其糖基化模式是更類似于哺乳動物(Maras，van Die等，1999 ；Gerngross 2004 ;Ward, Lin 等，2004 ;Nevalainen, Te' ο 等，2005)。然而，并沒有研究這個系統中的聚糖修飾作用，而且50mg/L的表達水平是仍然很低。因此這個系統表達的rAAT也僅限于實驗室研究。如小鼠、兔、山羊和綿羊等動物表達系統也成功地表達了 rAAT (Carlson, Rogers等，1989 ；Archibald, McClenaghan 等，1990 ；Massoud, Bischoff 等，1991 ； Wright, Carver等，1991 ；Carver, Wright 等，1992 ；Ziomek, 1998).也從綿羊奶(DalrympIe 和 Garner,1998)和山羊奶(Ziomek，1998)中獲得大規模生產的rAAT。盡管從轉基因綿羊奶中分離的rAAT純度達99. 9%，然而在人類體內，痕量的天然綿羊AAT和α1-抗糜蛋白酶便可以誘導一種全身性抗體應答(Spencer, Humphries等,2005)。也有用植物表達系統生產rAAT,包括水稻細胞(Terashima,Murai等，1999)、轉基因番爺(Agarwal, Singh等,2008)和葉綠體(Nadai, Bally等，2009)。其中，轉基因番茄和葉綠體中rAAT的表達水平分別達到總蛋白質的1. 55%至2%。在水稻細胞中rAAT的產量達到200毫克/升。最近發現，谷物作物的胚乳細胞是很有潛力的可用于生產重組蛋白質的表達系統。水稻胚乳已被用來表達各種重組藥物蛋白，如人乳鐵蛋白(Suzuki, Kelleher等，2003)、人溶菌酶(Yang, Guo等,2003)、rhIGF-Ι融合和人粒細胞-巨噬細胞群激活因子(Ning, Xie等，2008 ；Xie, Qiu等，2008)。最近，水稻種子成功地應用于大規模生產的重組人血清白蛋白(He，Ning等，2011)。這些研究表明，水稻胚乳是具有成本效益和安全性的藥物蛋白質表達平臺。盡管使用不同的表達系統來表達rAAT已經取得了進步，然而大規模生產植物源重組人抗胰蛋白酶仍受到表達水平的限制。而且，至今未見有關使用水稻胚乳來大規模生產重組人抗胰蛋白酶的報道，也未見有關從水稻種子中分離純化重組人抗胰蛋白酶方法的報道
技術實現思路
本專利技術的一個目的是提供一種水稻遺傳密碼子優化的重組人抗胰蛋白酶基因，以提高人抗胰蛋白酶基因在水稻種子的表達水平；本專利技術稱0srAAT(0ryZasatiVa AAT)基因，具有如SEQ ID NO.1所示的序列。進一步地，本專利技術還提供了含有上述OsrAAT基因的載體，優選水稻胚乳細胞特異性表達載體，更優選具有如圖3所示的結構的載體。本專利技術的另一個目的是提供上述載體在制備OsrAAT轉基因水稻種子中的應用。本專利技術的另一個目的是提供一種制備OsrAAT轉基因水稻種子的方法，包括以下步驟(I)制備具有如SEQ ID NO.1所示序列的OsrAAT基因； (2)構建水稻胚乳細胞特異性表達的OsrAAT表達載體和選擇性標記基因載體；(3)將步驟2所獲得載體共轉化到水稻品種的愈傷再生組織中；(4)培養所述愈傷再生組織，經篩選和誘導獲得OsrAAT轉基因水稻植株；(5)培養OsrAAT轉基因水稻植株，獲得OsrAAT轉因水稻種子。其中，所述OsrAAT表達載體優選具有如圖3所示的結構。其中，所述選擇性標記基因載體優選具有如圖4所示的結構。本專利技術的再一個目的是提供一種從OsrAAT轉基因水稻種子中分離純化OsrAAT的方法，包括以下步驟(I)以OsrAAT轉基因水稻種子為原料制備OsrAAT提取液；(2)以陰離子交換層析對OsrAAT提取液進行初級純化，獲得初級OsrAAT洗脫液，其中所述陰離子交換層析的介質為DEAE sepharose FF;(3)以陽離子交換結合金屬螯合的復合層析對初級OsrAAT洗脫液進行中級純化，獲得中級OsrAAT洗脫液,其中所述復合層析的介質為MacroprepCHT-1 ；(4)以陰離子交換結合疏水作用的復合層析對中級OsrAAT洗脫液進行末級純化，獲得純化的OsrAAT,其中所述復合層析的介質為Capto Adhere。進一步地，上述方法包括以下步驟(I)以OsrAAT轉基因水稻種子為原料，將稻谷脫殼成半精米并研磨成80-100目的米粉，將所述米粉與提取緩沖液以重量(kg)/體積(L)為1: 5-1 10的比例混合，常溫下提取I小時后將得到的混合物經濾布式板框壓濾機壓濾，得到澄清的OsrAAT提取液；其中所述提取緩沖液的成分為20-25mM磷酸鹽緩沖液、l-4mM巰基乙醇，pH6. 9-7.1 ；(2)采用DEAE sepharose FF填料的層析柱進行初級分離純化,采用8_12個柱體積的PH為6. 9-7.1的20-25mM磷酸鹽緩沖液，以10本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種水稻遺傳密碼子優化的OsrAAT基因，具有如SEQ?ID?NO.1所示的序列。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊代常，施倩妮，張莉平，
申請(專利權)人：武漢禾元生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：