同種異基因腫瘤治療劑制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種用于治療腫瘤疾病的基于同種異基因腫瘤細(xì)胞的疫苗，以及一種用于制備這種疫苗的方法，此外還涉及用作疫苗的轉(zhuǎn)染的人腫瘤細(xì)胞。（*該技術(shù)在2024年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
同種異基因腫瘤治療劑本申請是申請日為2004年4月20日的第200480039664. 3號專利技術(shù)名稱為“同種異基因腫瘤治療劑”的中國專利申請的分案申請。本專利技術(shù)涉及一種用于治療腫瘤疾病的基于同種異基因腫瘤細(xì)胞的疫苗，以及一種制備這種疫苗的方法。此外，本專利技術(shù)還涉及轉(zhuǎn)染的人腫瘤細(xì)胞作為疫苗的用途。除了治療癌性疾病的傳統(tǒng)方法(如放療和化療,從20世紀(jì)50年代以來它們就構(gòu)成了治療進(jìn)展性和播散性腫瘤疾病的唯一選擇)之外，當(dāng)面對著轉(zhuǎn)移性腫瘤時，免疫治療似乎是一種很有如途的方法。免疫治療的目的是通過來源于基因
的修飾技術(shù)來增強(qiáng)對抗腫瘤疾病的天然應(yīng)答，據(jù)此增加免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的“警惕性”，并 提高肌體本身對抗腫瘤的防御反應(yīng)。一些惡性疾病例如進(jìn)展性腎細(xì)胞癌似乎對免疫治療的干預(yù)是相當(dāng)敏感的，但是利用細(xì)胞因子(例如IL-2和IFN-a )的全身治療有時伴有嚴(yán)重的副作用。因此，已經(jīng)發(fā)展出了其他的免疫治療方案。目前絕大多數(shù)的臨床研究都依賴于取出腫瘤、隨后用治療基因在離體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞、照射腫瘤細(xì)胞群以及隨后重新植入經(jīng)修飾的腫瘤細(xì)胞。通過這樣的腫瘤疫苗接種，可以不同程度地增加抗腫瘤效應(yīng)，增加的程度依賴于所轉(zhuǎn)染的治療基因。根據(jù)這種方法以及試驗動物研究的結(jié)果，已經(jīng)批準(zhǔn)了多個I期和II期臨床研究(Finke et al. , 1997 ；Wittig et al.，2001)。但是，這些研究的初步結(jié)果表明除了對治療的較好的耐受性之外，僅僅在少數(shù)病例中觀察到了部分或完全反應(yīng)。基因轉(zhuǎn)移⑶40L/⑶154能在結(jié)腸癌小鼠模型中誘導(dǎo)腫瘤的根除和免疫力(Sun等，2000)。本專利技術(shù)的申請者/受讓人發(fā)現(xiàn)，向腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移人白介素7 (IL-7)的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞的敏感性的增加，尤其是自體轉(zhuǎn)移(Finkeet al. , 1997, Cancer Gene Ther. 4:260-268)。相似地,本專利技術(shù)者證實，向自體腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移進(jìn)兩種治療基因(IL-7、GM-CSF)之后，可以在50%患者中觀察到顯著的臨床反應(yīng)(W002/060476)。從US 5，681，562的闡述中已知，給患有某些癌癥的患者體內(nèi)注射已經(jīng)以編碼細(xì)胞因子的DNA或RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可刺激患者的免疫系統(tǒng)對抗腫瘤抗原。在專利說明書中，描述了其中用編碼IL-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞的試驗。也描述了一個體內(nèi)試驗，其中在小鼠的結(jié)腸癌模型中測試了治療的療效。與對照組比較，經(jīng)皮下注射轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出明顯更慢的腫瘤生長。利用人轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞的體外試驗顯示其顯著增加了 IL-2的表達(dá)水平。除了缺乏小鼠模型以外的臨床數(shù)據(jù)外，在這些試驗中被采用作為表達(dá)載體的病毒載體也被認(rèn)為是不利的載體。減毒疫苗株的不穩(wěn)定性不能確保其不被逆轉(zhuǎn)成為有毒株，以及病毒組分本身可以是免疫原性的，這將使得患者的免疫系統(tǒng)減弱它們的療效。在此所列的這些缺點僅僅是病毒系統(tǒng)的缺點的一部分，這明顯削弱了該系統(tǒng)作為基因治療載體的用途。一些文章顯示用細(xì)胞因子基因聯(lián)合生長因子GM-CSF獲得了最佳的治療效果(Paillard，1998，Hum. Gene Ther.9:2457-2458 ；Schadendorf et al.，1995，J. Mo1.Med. 73:473-477)。GM-CSF在腫瘤抗原接種中的重要性也體現(xiàn)在其增強(qiáng)針對肽疫苗接種的臨床及免疫學(xué)的抗腫瘤應(yīng)答(Jager et al.，i996)。呈遞抗原的樹突狀細(xì)胞的活化以及對效應(yīng)細(xì)胞群的刺激似乎在這個方面起到了關(guān)鍵作用。但是，至今還不清楚哪個細(xì)胞因子基因聯(lián)合免疫原性制劑和GM-CSF能觸發(fā)最有效的抗腫瘤應(yīng)答。在小鼠試驗中，顯示用編碼IL-7的表達(dá)構(gòu)建體的接種生成了抗腫瘤效應(yīng)(Miller et al., 1993,Blood 18:3686-3694 ；Murphy et al., 1993,J.Clin.1nvest. 92:1918-1924)。也顯示細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)與IL-7或IL-7轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行孵·育導(dǎo)致了小鼠體內(nèi)的腫瘤消退(Jicha et al. , 1991 ；Hock et al.，1993)，以及用IL-7和B7. 1/CD80的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致了 CD28+CD25+T細(xì)胞的浸潤及免疫力(Cayeux et al.，1995)。至今還沒有實現(xiàn)治療的成功，甚至在小鼠模型中也沒有成功。此外，在涉及通過利用質(zhì)粒DNA或寡核苷酸序列的基因治療而刺激免疫應(yīng)答的試驗中，觀察到某些包括CpG基序(CpG=未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸)的核酸序列具有巨大的免疫刺激作用(Schmidt-Wolf et al. , 1989, J.1mmunol. Methods 125:185-189)。基于這個原因，在非常早的時候，免疫刺激序列(ISS)就已經(jīng)在基于DNA的抗感染性病原體的免疫接種方案中被用作佐劑。在小鼠試驗中，證實了注射富含CpG的DNA序列導(dǎo)致了對B細(xì)胞的強(qiáng)烈激活并刺激了某些細(xì)胞因子(例如IL-6和GM-CSF)的表達(dá)。在小鼠模型中也顯示，在腫瘤接種前3天，用CpG寡脫氧核苷酸(0DN)與融合蛋白的共同免疫接種可以阻止小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(Liu et al.，1998)。在WO 98/18810中詳細(xì)地解釋了對含有免疫刺激性CpG的ISS的用途及合成的闡述。WO 00/04918顯示了用編碼例如干擾素、和GM-CSF的基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。質(zhì)粒可以被用作為表達(dá)載體。該申請闡述了一種用免疫治療方法治療腫瘤疾病的概念。沒有顯示相關(guān)的證明要求保護(hù)的疫苗的療效的體內(nèi)或體外數(shù)據(jù)或臨床結(jié)果。需附加說明的是這些沒有限定其應(yīng)用的基于質(zhì)粒的載體在人體基因治療中是沒有用的，因為除了治療序列外，它們還包括其復(fù)制所必需的遺傳學(xué)功能單位。它們也包括其選擇所需的抗生素耐藥基因。結(jié)果是非治療所需的哺乳動物或細(xì)菌的蛋白質(zhì)的持續(xù)表達(dá)。盡管研究了多年以及有著有前途的方法，但是通過施用免疫原性物質(zhì)發(fā)展出一種基于對抗腫瘤疾病的免疫功能的有效治療仍是不可能的。本專利技術(shù)的目的是提供一種用于治療與細(xì)胞因子有關(guān)的疾病(例如癌性疾病)的藥物組合物形式的疫苗，它是特異性的和有效的，并特異性地誘導(dǎo)了腫瘤特異性的免疫應(yīng)答。此外，也將提供了一種制備這種疫苗的方法。通過獨(dú)立權(quán)利要求的要素實現(xiàn)該目的。在本專利技術(shù)中，將采用下面的含義同種異基因起源于同一物種的遺傳學(xué)不一致的個體，與“自體”(來自同一個體的細(xì)胞)相反APC 抗原呈遞細(xì)胞B7. 1/CD80 分化抗原簇 80CD40L/CD154分化抗原簇40配體DC樹突狀細(xì)胞dSLIM雙萃環(huán)免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸GM-CSF粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子IL-7白介素-7ISS免疫刺激核酸序列 MIDGE最小免疫學(xué)定義的基因表汰載體IM丨DCiR &是Mologen AG的注冊商標(biāo))ODN寡脫氧核苷酸TAA腫瘤相關(guān)抗原在下面所述的內(nèi)容中，應(yīng)當(dāng)如下理解許多常用的術(shù)語轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在本專利技術(shù)中的含義是經(jīng)本專利技術(shù)的編碼表達(dá)載體在離體處理過的人同種異基因腫瘤細(xì)胞，因此，作為這種處理的結(jié)果，所述細(xì)胞表達(dá)所編碼的細(xì)胞因子和共刺激因子序列，并能用作腫瘤疾病的一種免疫治療工具。在本專利技術(shù)中，術(shù)語“共刺激因子”和/或細(xì)胞因子代表天然存在的共本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
核酸分子，其編碼白介素?7（IL?7）、粒細(xì)胞?巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM?CSF）、CD40L/CD154和B7.1/CD80。

【技術(shù)特征摘要】
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：托米斯拉夫·多布里克，布格哈特·維蒂希，曼努埃爾·施密特，
申請(專利權(quán))人：莫洛根股份公司，
類型：發(fā)明
國別省市：