一種基因重組大腸桿菌及其高效生產普魯蘭酶的方法，屬于微生物發酵技術領域。本發明專利技術將質粒pET20b(+)的信號肽PelB與長野芽孢桿菌（Bacillusnaganoensis）CCTCC?NO：M2012388普魯蘭酶基因pul連接，并共同插入表達載體pET28a(+)中，構建帶有信號肽和目的基因的重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-PelB-pul。將自誘導培養和添加甘氨酸調控細胞透性的策略用于胞外普魯蘭酶的發酵生產，采用乳糖濃度10g/L的自誘導培養基，于37℃、200rpm震蕩培養約2h后，添加終濃度6g/L的甘氨酸并轉入20℃下培養70h，胞外普魯蘭酶酶活達505U/mL，比野生菌出發菌株的酶活力提高1260倍。本發明專利技術的應用具有重要意義。
【技術實現步驟摘要】
—種基因重組大腸桿菌及其高效生產普魯蘭酶的方法
，屬于微生物發酵生產普魯蘭酶的
技術介紹
普魯蘭酶(pullulanase，EC. 3. 2.1. 41)是一類可以特異性水解普魯蘭、支鏈淀粉及其極限糊精中的α-1，6_糖苷鍵的脫支酶。在淀粉糖化過程中，普魯蘭酶與糖化酶共同作用，普魯蘭酶切割支鏈淀粉分支點，糖化酶只需切割線性的低聚糖，即可顯著地提高淀粉的水解效率。使用普魯蘭酶不僅可降低糖化酶用量，還可使DE值提高到97%以上，提高水解產物葡萄糖或麥芽糖的質量和純度。目前已發現多種產普魯蘭酶的微生物，但大部分都無法應用于工業生產，主要原因有(I)酶的耐熱耐酸性差，淀粉的糖化過程在55°c -60°c、pH 4. 5-5. O的范圍內進行， 而大多數種類的普魯蘭酶在此范圍內活性很低；(2)酶活水平低，很多普魯蘭酶產生菌胞外分泌普魯蘭酶的能力不強，分泌的普魯蘭酶又容易遭到蛋白酶的降解，因此難以進行工業化生產。目前，普魯蘭酶的工業化生產菌株極少，只有諾維信公司和杰能科公司有能力工業化生產并銷售此酶。諾維信公司的普魯蘭酶產品占領了中國乃至世界95%以上的市場份額，其價格相當昂貴。我國關于普魯蘭酶的研究主要集中在產普魯蘭酶菌株的篩選和優化等方面，效果均不太理想。隨著基因工程技術的發展，利用基因工程技術改造菌種，進一步提高酶的產量及活性，降低生產成本成為可能，并在世界范圍內越來越得到重視。近幾年， 我國學者利用基因工程技術構建基因工程菌株，取得了一定的效果。例如，2006年，夏子芳 用大腸桿菌表達系統表達海棲熱胞菌普魯蘭酶基因，得到少量酶活；2008年，張明焱在大腸桿菌表達系統中表達Iicheniforms的普魯蘭酶編碼基因，獲得5. 6 U/mL酶活；2010年,王淑軍等從深海古菌Thermococcus siculi HJ21中PCR擴增出一種新的普魯蘭酶基因，并在大腸桿菌中得到表達，但酶活較低。綜上所述，在普魯蘭酶的微生物發酵生產過程中，不論是野生菌還是工程菌，主要存在的問題就是胞外酶活較低，造成了普魯蘭酶的生產成本上升，形成工業化生產的障礙。本專利技術利用基因工程表達調控技術，構建了適用于普魯蘭酶表達分泌的基因工程菌株，在自誘導培養基中實現過量表達普魯蘭酶，并通過添加甘氨酸改變細胞通透性而進一步提高胞外普魯蘭酶的產量，為工業化生產奠定了基礎。
技術實現思路
( I)要解決的技術問題本專利技術的目的是提供基因重組大腸桿菌及其高效生產普魯蘭酶的方法。本專利技術目的不僅僅在于通過微生物菌株發酵生產胞外普魯蘭酶，而是通過構建適合的大腸桿菌表達系統將具有優良的耐酸耐熱性能的長野芽孢桿菌普魯蘭酶基因在大腸桿菌中獲得高效重組表達，而且利用自誘導培養基并通過添加甘氨酸調控細胞透性的策略進一步提高重組大腸桿菌生產胞外普魯蘭酶的能力和產量，從而開發新型重組普魯蘭酶的生產工藝和應用價值。(2)技術方案本專利技術首先構建表達長野芽孢桿菌UaciBm naganoensisXCTCC M 2012388普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌，將來源于長野芽孢桿菌的普魯蘭酶基因在大腸桿菌中進行重組表達，在此基礎上，將重組大腸桿菌在自誘導培養基中發酵培養以高效表達普魯蘭酶，并通過添加甘氨酸獲得胞外普魯蘭酶的高效生產。一種長野芽抱桿菌naganoensis) LBMAE-1,已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NO M 2012388 ；來源于CCTCC NO M 2012388菌株的普魯蘭酶基因/^7，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。用CCTCC NO M 2012388菌株構建重組大腸桿菌疋coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/^7的方法，將來源于CCTCC NO M 2012388菌株的普魯蘭酶基因在大腸桿菌中進行重組表達；步驟為一、普魯蘭酶基因的獲得CCTCC NO Μ 2012388 培養基=CaCl2 O. 25 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 g/L,(NH4) 2SO4 0.2 g/L,酵母提取物2 g/L,無水葡萄糖5 g/L, KH2PO4 3 g/L,無機鹽溶液 I mL/L，用雙蒸水配制，pH 5. O。無機鹽溶液=ZnSO4 · 7H20 O.1 g/L, MnCl2 · H2O O. 03 g/ L, H3BO3 O. 3 g/L, CoCl2 · 6H20 0. 2 g/L, CuCl2 · 2H20 0. 01 g/L, NiCl2 · 6H20 0. 02 g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 03 g/L。將CCTCC NO M 2012388菌種接種于含有25 mL培養基的250 mL搖瓶中，于37°C、 200 rpm振蕩培養7 2 h。培養結束后，將菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集細胞利用基因組 DNA 提取試劑盒 Genomic DNA Extraction Miniprep System (VI0GENE 公司)提取基因組DNA。合成引物1:5，- RaacaGGATCCaRatRRRaacaccacaaaC _3，，合成弓I物 2 :5’ - attccctcgagtttaccatcagatgggct -3’。引物I含有BamHl限制性酶切位點，引物2含有Xho I限制性酶切位點。PCR 反應體系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,dNTP(25 mmol/L)0. 5 yL，引物 I (50 pmol/μ L) I yL，引物 2 (50 pmol/μ L) I μ L，基因組 DNA 5 μ L，Taq DNA polymerase (5 U/μ L) 0. 5 μ L。以CCTCC NO M 2012388基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增普魯蘭酶基因。 PCR反應過程95°C預變性5 min ；95°C I min、60°C O. 5 min、72°C 2 min，進行30個循環； 72°C延伸 10 min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。DNA溶液中加入1/10體積的乙酸鈉溶液(3 mol/L, pH 5. 2)和2倍體積無水乙醇，-20°C沉淀 lh。12000 rpm 于 4°C離心 30 min。加入 75% 乙醇 500 μ L 洗滌，12000 rpm 于4°C離心30 min，無菌操作臺吹干后溶于適量TE緩沖液中，所得普魯蘭酶基因立即使用或_20°C保存。二、含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌的構建目的基因Z^/7及質粒pET20b (+)的酶切利用質粒提取試劑盒Min1-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技術有限公司)提取質粒pET20b (+)。按照水、緩沖液、PCR產物或質粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋， 振蕩使液體充分混勻，置于離心機內離心2s使液體集中于管底，37°C水浴3h，在管中加入 1/10的Loading Buffer或將管置于65°C保溫本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種長野芽孢桿菌（Bacillus?naganoensis）LBMAE?1，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC?NO：M?2012388；來源于CCTCC?NO：M?2012388菌株的普魯蘭酶基因pul，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO:?1，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:?2。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：聶堯，徐巖，嚴偉，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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