本發(fā)明專利技術公開了氨肽酶及其高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，涉及一種氨肽酶及其高產(chǎn)微生物菌株的高通量篩選方法。將單菌落接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的深孔板I的孔中，搖床培養(yǎng)，將深孔板I深孔中的種子液對應地接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的深孔板II對應的深孔中，搖床培養(yǎng)，將深孔板II離心，上清液為粗酶液。在酶標板的微孔中加入緩沖液和顯色底物溶液或熒光底物溶液，再加入稀釋的待測粗酶液，于30～70℃水浴反應10～30min，反應結(jié)束時立即加入30～50％乙酸溶液并終止反應。采用酶標儀測定反應液的吸光度或熒光強度，根據(jù)標準曲線和粗酶液的稀釋倍數(shù)計算酶活。本發(fā)明專利技術實現(xiàn)了高通量培養(yǎng)、粗酶液的高通量制備及酶活的高通量測定的目標。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及一種氨肽酶及其高產(chǎn)微生物菌株的高通量篩選方法，屬于微生物育種、酶工程和發(fā)酵工程
技術介紹
氨肽酶(aminopeptidase)是蛋白水解酶中外肽酶的一類，它們能從蛋白質(zhì)和多肽鏈的N末端順序水解氨基酸，其催化機理可以用下式表示權利要求1.，包括如下步驟 挑取氨肽酶產(chǎn)生菌的單菌落，接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的深孔板I的孔中，蓋上深孔板的蓋子，于30 40°C、180 300rpm搖床培養(yǎng)4 IOh ;將深孔板I中的種子液對應地接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的深孔板II中，于30 40°C、180 300rpm搖床培養(yǎng)16 48h ;將深孔板II放置于孔板離心機，5000 IOOOOXg離心5 30min ;深孔板II的深孔中的上清液為粗酶液；以微量化梯度稀釋法將粗酶液適當稀釋；用酶標板法測定粗酶液的酶活，在酶標板的微孔中加入緩沖液和顯色底物溶液或熒光底物溶液，加入稀釋的待測粗酶液，以蒸餾水作空白對照，于30 70°C水浴反應10 30min，反應結(jié)束立即加入30 50%乙酸溶液終止反應；采用酶標儀測定反應液的吸光度或熒光強度，根據(jù)標準曲線和粗酶液的稀釋倍數(shù)計算酶活；根據(jù)酶活測定結(jié)果，選擇對應的菌株進行搖瓶復篩，獲得氨肽酶高產(chǎn)菌株。2.根據(jù)權利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述氨肽酶產(chǎn)生菌的單菌落為自然界的含菌樣品或突變株。3.根據(jù)權利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述液體種子培養(yǎng)基為麥芽糊精8 15g/L、酵母粉2 10g/L、蛋白胨2 10g/L、磷酸二氫鉀0. 5 1. 5g/L、硫酸鎂 0.1 0. 5g/L、pH7. 0、0.1MPa 滅菌 30min。4.根據(jù)權利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽糊精15 30g/L、酵母粉2 15g/L、蛋白胨2 10g/L、牛肉膏I 20g/L、磷酸二氫鉀 0. 5 3. Og/L、硫酸鎂 0. 05 0. 5g/L、氯化鈉 0. 5 1. 5g/L、pH6. 5 7. 5,0.1MPa滅菌30min。5.根據(jù)權利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述酶反應所用的緩沖液為Tris-HCl緩沖液、磷酸二氫鉀緩沖液、磷酸鈉緩沖液、HEPES緩沖液和氨-氯化銨緩沖液之中的一種。所述緩沖液的pH為6. 5 8. 5 ;緩沖液濃度為0. 02 0.2mol/L。6.根據(jù)權利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述顯色底物是氨基酸對硝基苯胺。7.根據(jù)權利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述氨基酸對硝基苯胺為丙氨酸對硝基苯胺、精氨酸對硝基苯胺、天冬酰胺對硝基苯胺、天冬氨酸對硝基苯胺、半胱氨酸對硝基苯胺、谷氨酰胺對硝基苯胺、谷氨酸對硝基苯胺、組氨酸對硝基苯胺、異亮氨酸對硝基苯胺、甘氨酸對硝基苯胺、亮氨酸對硝基苯胺、賴氨酸對硝基苯胺、甲硫氨酸對硝基苯胺、苯丙氨酸對硝基苯胺、脯氨酸對硝基苯胺、絲氨酸對硝基苯胺、蘇氨酸對硝基苯胺、色氨酸對硝基苯胺、酪氨酸對硝基苯胺或纈氨酸對硝基苯胺。8.根據(jù)權利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述熒光底物是氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素；所述氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素為下列化合物之一丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、天冬氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、半胱氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酰胺-7-氨基-4-甲基香豆素、谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、組氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、異亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、賴氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、絲氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、蘇氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、酪氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、纈氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素。9.根據(jù)權利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述顯色底物溶液濃度為2 20 ii mol/L,熒光底物溶液濃度2 20nmol/L ;顯色底物用于酶活測定比色的波長為360 450nm ;熒光底物用于酶活測定的激發(fā)光波長為340 400nm，發(fā)射光波長為420 480nm。10.根據(jù)權利要求1所述的氨肽酶高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，其特征在于，所述氨肽酶種類的判斷方法如下若底物為亮氨酸對硝基苯胺或亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素時有較高的酶活，而添加其它氨基酸對硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物時無酶活或者酶活較低，則表明所測樣品含有亮氨酸氨肽酶；若添加底物為甲硫氨酸對硝基苯胺或甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素時有較高的酶活，而添加其它氨基酸對硝基苯胺或氨基酸-7-氨基-4-甲基香豆素底物時無酶活或者酶活較低，則表明所測樣品含有甲硫氨酸氨肽酶，其它的氨肽酶如此類推。全文摘要本專利技術公開了，涉及一種氨肽酶及其高產(chǎn)微生物菌株的高通量篩選方法。將單菌落接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的深孔板I的孔中，搖床培養(yǎng)，將深孔板I深孔中的種子液對應地接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的深孔板II對應的深孔中，搖床培養(yǎng)，將深孔板II離心，上清液為粗酶液。在酶標板的微孔中加入緩沖液和顯色底物溶液或熒光底物溶液，再加入稀釋的待測粗酶液，于30～70℃水浴反應10～30min，反應結(jié)束時立即加入30～50％乙酸溶液并終止反應。采用酶標儀測定反應液的吸光度或熒光強度，根據(jù)標準曲線和粗酶液的稀釋倍數(shù)計算酶活。本專利技術實現(xiàn)了高通量培養(yǎng)、粗酶液的高通量制備及酶活的高通量測定的目標。文檔編號C12N1/02GK102994387SQ20121054322公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權日2012年9月17日專利技術者姜文俠, 楊玉蘭, 劉琦, 楊萍, 陳寧 申請人:天津工業(yè)生物技術研究所本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
氨肽酶及其高產(chǎn)菌的高通量篩選方法，包括如下步驟：挑取氨肽酶產(chǎn)生菌的單菌落，接種于裝有液體種子培養(yǎng)基的深孔板I的孔中，蓋上深孔板的蓋子，于30～40℃、180～300rpm搖床培養(yǎng)4～10h；將深孔板I中的種子液對應地接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的深孔板II中，于30～40℃、180～300rpm搖床培養(yǎng)16～48h；將深孔板II放置于孔板離心機，5000～10000×g離心5～30min；深孔板II的深孔中的上清液為粗酶液；以微量化梯度稀釋法將粗酶液適當稀釋；用酶標板法測定粗酶液的酶活，在酶標板的微孔中加入緩沖液和顯色底物溶液或熒光底物溶液，加入稀釋的待測粗酶液，以蒸餾水作空白對照，于30～70℃水浴反應10～30min，反應結(jié)束立即加入30～50%乙酸溶液終止反應；采用酶標儀測定反應液的吸光度或熒光強度，根據(jù)標準曲線和粗酶液的稀釋倍數(shù)計算酶活；根據(jù)酶活測定結(jié)果，選擇對應的菌株進行搖瓶復篩，獲得氨肽酶高產(chǎn)菌株。
【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：姜文俠，楊玉蘭，劉琦，楊萍，陳寧，
申請(專利權)人：天津工業(yè)生物技術研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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