一種脂肪酶抑制劑的篩選方法技術

本發明專利技術涉及一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，具體涉及一種利用薄層色譜生物自顯影技術篩選脂肪酶抑制劑的方法，將供試品溶解于水和/或有機溶劑中，然后將供試品溶液點涂于薄層板上，并將該板放入展開劑中展開、取出、晾干、備用；將上述步驟中得到的薄層板浸漬于底物溶液中，揮干溶劑后再浸漬于脂肪酶溶液中，取出薄層板并置于溫度為20℃-40℃條件下進行酶促反應，待反應完全后將薄層板浸漬于顯色劑溶液中進行顯色反應，得到紫色背景下的白色和/或棕黃色斑點結果圖。所述脂肪酶抑制劑的篩選方法不需要復雜的儀器和設備，操作簡單，實驗耗費低，適合一般實驗室操作，而且靈敏度和專屬性高于常規篩選方法，篩選結果直觀、易于辨識和記憶。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，具體涉及一種利用薄層色譜生物自顯影技術篩選脂肪酶抑制劑的方法。
技術介紹
脂肪酶又稱三酰基甘油酰基水解酶，是一類促進脂質(如甘油三酯、脂肪、油等)水解或合成的水溶性酯酶。它普遍存在于動植物和微生物中。而人體的胰臟和脂肪組織中含有較多的脂肪酶，腸液和胃液中也含有一定量的脂肪酶，各類脂肪酶控制著消化、吸收、 脂肪重建和脂蛋白代謝等過程。近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的變化，脂質代謝紊亂的患病率快速攀升，其不僅是動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的重要危險因素，同時還與糖尿病、脂肪肝、腎病、高血壓、肥胖癥及代謝綜合征等諸多常見重大疾病密切相關。目前，醫學界公認的脂質代謝紊亂調節途徑包括一、降低甘油三酯含量； 二、降低低密度脂蛋白膽固醇含量；三、升高高密度脂蛋白膽固醇含量。現在，主要應用他汀類藥物通過第三種途徑降低膽固醇，而前兩種調解途徑均可以通過脂肪酶抑制劑來得以實現。脂肪酶抑制劑能有效抑制胃/胰脂肪酶活性，減少胃腸道飲食脂肪水解，抑制脂肪組織釋放非酯化脂肪酸，從而減少甘油三酯及低密度脂蛋白膽固醇的合成，最終使血清總膽固醇和甘油三酯水平下降，通過外源性代謝途徑調節脂質代謝。目前，臨床主要應用的脂肪酶抑制劑是奧利司他，但是，2010年5月美國食品藥品監督管理局(FDA)警告其存在可能引起嚴重肝損害的風險；2011年3月4日，我國藥品不良反應監測中心也發布了第36期 《藥品不良反應信息通報》要求關注奧利司他安全性問題。相比之下，天然藥物來源的脂肪酶抑制劑的成分作用溫和、毒副作用小、來源廣泛以及價格相對低廉等優勢突顯。近年來針對天然藥物來源的脂肪酶抑制劑的篩選一直是相關領域的研究熱點，如苦丁茶提取物、葡萄種籽提取物、木犀草素及熊果酸等均具有抑制脂肪酶的活性。但是傳統的體內、體外多種實驗的篩選方法對有效化合物的純度及應用量均有較高要求，而天然藥物的藥效成分不明確，且多為多成分、多靶點協同作用，給天然藥物來源的脂肪酶抑制劑的篩選帶來困難，而且該種篩選方法需要消耗大量樣品，勞動強度大，不能適應大量藥品的同時篩選。采用紫外分光光度法及MTT比色法進行脂肪酶篩選時受到溶劑和樣品濃度的限制，因此受試樣品的范圍小。所以，建立快速從天然藥物提取物中篩選出具有抑制脂肪酶活性的成分及評價方法具有重要的現實意義。
技術實現思路
本專利技術要解決的問題是，針對上述技術的不足而提供了一種利用薄層色譜生物自顯影技術，快速從天然產物或單體化合物中篩選脂肪酶抑制劑的方法，該方法操作簡單、實驗耗費低、靈敏度和專屬性高。本專利技術的篩選方法為薄層色譜生物自顯影法，通過如下步驟實現(I)將供試品溶解于水和/或有機溶劑中，然后將供試品溶液點涂于薄層板上，并將該板放入展開劑中展開、取出、晾干、備用。所述有機溶劑可以是體積溶度為90% 98% 的甲醇溶液或是乙醇溶液。(2)將步驟(I)中得到的薄層板浸潰于底物溶液中，揮干溶劑后再浸潰于脂肪酶溶液中，取出薄層板并置于溫度為20°C -40°C條件下進行酶促反應，酶促反應時間為5-60 分鐘。待反應完全后將薄層板浸潰于顯色劑溶液中進行顯色反應，顯色反應時間為5-60分鐘。所述薄層板為硅膠板。所述步驟(I)中的供試品溶液的點樣量為1-20 μ L，供試品的點樣量為10pg-lmg。。所述步驟(I)中所述的展開劑為石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、乙醇、乙酸、氨水、醋酸銨等中的一種或幾種的混合物。優選的，將石油醚和乙酸乙酯按照體積比為2:1的比例混合配制成展開劑。所述底物溶液為肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶解于石油醚的溶液，肉豆蘧酸-2-萘酯溶液的濃度為O. 25-350mmol/L。所述步驟(2)中的脂肪酶溶液的配制方法是，先將三羥甲基氨基甲烷和無水氯化鈣粉按照重量比為2. 5-4. 5:1的配比溶于去離子水中，調節混合液的pH值為6. 5-8. 0，配制成三羥甲基氨基甲烷摩爾濃度為20-100mmol/L的酶促反應緩沖液并冷藏保存；將脂肪酶溶解于所述酶促反應緩沖液，配制成濃度為5-200u/mL的脂肪酶溶液。所述顯色劑溶液為固藍B鹽溶液，濃度為O. 1-lOOmg/mL。薄層色譜生物自顯影法是結合了比色法與色譜分離技術兩者的優點，是一種集鑒定、分離和活性測定于一體的藥物篩選方法。篩選原理為脂肪酶通過酶促反應產生的 β -萘酚與固藍B鹽顯色反應產生紫色物質，具有抑制脂肪酶活性的物質抑制該反應發生， 在薄層板上表現為紫色背景下的白色和/或棕黃色斑點。本專利技術的優點是1、所述脂肪酶抑制劑的篩選方法不需要復雜的儀器和設備，操作簡單，實驗耗費低，適合一般實驗室操作，而且靈敏度和專屬性高于常規篩選方法。2、以彩色圖像形式提供篩選結果，形象直觀，易于辨識和記憶。3、篩選過程以薄層板為媒介，不受溶劑和樣品濃度的限制，使得受試樣品的種類更為廣泛。4、能從天然藥物中快速篩選出具有抑制脂肪酶活性的成分，而且相對與合成藥物，該天然脂肪酶抑制劑的價格相對低廉， 副作用小，使消費者獲得更大益處。附圖說明圖I為實施例圖2為實施例圖3為實施例圖4為實施例圖5為實施例圖6為實施例圖7為實施例圖8為實施例I中兩種北沙參提取物的活性篩選結果圖。 2中奧利司他的活性檢測結果圖 3中奧利司他的檢測限檢測結果圖。4中齊墩果酸的活性篩選結果圖。5中迷迭香酸的活性篩選結果圖。6中木犀草素的活性篩選結果圖。7中葡萄籽水提物的活性篩選結果圖。8中白藜蘆醇的活性篩選結果圖。4圖9為實施例9中β -谷甾醇的活性篩選結果圖。具體實施方式下面結合實施例，對本專利技術作進一步說明實施例I酶促緩沖液的配制準確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末I. 212g和無水氯化鈣粉末 O. 455g溶劑于去離子水中，用鹽酸調節混合液的pH值至6. 5，用去離子水將溶液最終定容至500mL，配制成三羥甲基氨基甲烷濃度為20mmol/L的酶促反應緩沖液(pH=6. 5)，置于 2-4 °C冰箱中保存、備用。底物溶液的配制將肉豆蘧酸-2-萘酯粉末溶于石油醚溶解中，配制成濃度為 16mmol/L的底物溶液。脂肪酶溶液的配制在上述酶促緩沖液中加入豬胰脂肪酶，配制成濃度為lOu/mL 的溶液。顯色劑溶液的配制將固藍B鹽粉末溶于去離子水中，配制成濃度為O. 5mg/mL的顯色劑溶液。供試品溶液的制備分別稱取兩種北沙參藥材細粉(選自安徽亳州藥材市場)各 2g，分別加入體積濃度為95 %的甲醇溶液50mL，超聲波處理30分鐘后過濾、濾液棄去，在藥渣中加入ImL甲醇溶液溶解，得到兩種北沙參供試品溶液。將上述供試品溶液分別點于兩塊娃膠板上，點樣量均為20 μ L,然后將娃膠板置于層析缸中展開后，展開劑為體積比為2:1的石油醚與乙酸乙酯的混合液，取出硅膠板并揮干展開劑，備用。將上述硅膠板浸潰于底物溶液中，揮干溶劑后再浸潰于脂肪酶溶液中，然后將硅膠板放置于26°C條件下反應6分鐘。反應完成后將硅膠板浸潰于顯色劑中，26°C條件下顯色反應15分鐘。結果見附圖I所示，具有抑制脂肪酶活性的物質，發生了抑制反應的在薄層板上表現為紫色背景下的白色和/或棕黃色斑點。實施例2酶促緩沖液的配制準確稱量三羥甲基氨基甲烷粉末3. 029g和無水氯化鈣粉末O.91g溶劑于去離子水中，用鹽酸調節混合液的pH值至7. 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種脂肪酶抑制劑的篩選方法，其特征在于：所述篩選方法為薄層色譜生物自顯影法，其步驟包括：（1）將供試品溶解于水或有機溶劑或水與有機溶劑的混合物中，然后將供試品溶液點涂于薄層板上，并將該板放入展開劑中展開、取出、晾干、備用；（2）將步驟（1）中得到的薄層板浸漬于底物溶液中，揮干溶劑后再浸漬于脂肪酶溶液中，取出薄層板并置于溫度為20℃?40℃條件下進行酶促反應，待反應完全后將薄層板浸漬于顯色劑溶液中進行顯色反應。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳弢，唐吉鶴，陶宏迅，
申請(專利權)人：上海中醫藥大學，
類型：發明
國別省市：