本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種羧甲基纖維素酶活力測定方法。經(jīng)過考察顯色劑用量、顯色時間、靜置時間、羧甲基纖維素鈉底物濃度、酶促反應溫度、酶促反應時間、酶液稀釋度等猴頭菌培養(yǎng)物活性成分酸性羧甲基纖維素酶活力測定的影響因素，以及該測定方法的精密度與適應性，最終確立了酸性羧甲基纖維素酶活力的測定方法。本發(fā)明專利技術(shù)具有測定方法簡便快速，測定現(xiàn)象清晰明了，測定結(jié)果準確可靠。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及纖維素酶活力測定方法，具體說是一種羧甲基纖維素酶活力 (CMCNa-DNS)的測定方法。
技術(shù)介紹
纖維素酶(Cellulase)是一種多組分的復合酶，不同來源的纖維素酶其組成及各組分比例有較大差異。一般來講，纖維素酶包括外切β-1，4-葡聚糖酶(Exop-1， 4-glucanase,E C3. 2·1. 91)、內(nèi)切 β-1，4-葡聚糖酶(Endop-1,4-glucanase,E C3. 2.1. 4) 和纖維二糖酶(Cellobiase，E C3. 2.1. 21)。不同來源的纖維素酶制劑產(chǎn)品中三種酶組分含量的比例不同，因此其最終的表觀酶活力會有差異。同時纖維素酶作用的底物也比較復雜，致使纖維素酶活力的測定方法很多，且方法復雜而不統(tǒng)一。常用的方法有羧甲基纖維素糖化力法、羧甲基纖維素液化力法、濾紙?zhí)腔ΨāV紙崩潰法和棉花糖化力法等。上述測定方法中，羧甲基纖維素糖化力主要代表外切β_1，4葡聚糖苷酶和內(nèi)切酶的活力總和， 在研究和實際生產(chǎn)中應用比較普遍。國內(nèi)外采用羧甲基纖維素糖化法測定纖維素酶活力的方法很多。目前，國際上有較公認的IPUAC推薦的纖維素酶測定方法(Τ. K. GHOSE, 1987)，該方法分別對來自三個廠家 (Primfast CL購自杰能科公司，Cellusoft L購自諾維信公司,Α5為本公司自主研發(fā)產(chǎn)品) 纖維素酶進行多次檢測，其變異系數(shù)達2%以上。造成較大誤差的原因可能是加入的羧甲基纖維素鈉濃度高和粘度大，容易在操作過程中帶來較大誤差，且該方法反應時間為30分鐘，利用比色管顯色后需稀釋用分光光度計檢測吸光度值，整個操作繁瑣且耗時；另外，該方法DNS (3，5- 二硝基 水楊酸)試劑配制未經(jīng)定容，從而造成批次間測定結(jié)果存在較大差巳
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的測定過程復雜，測定不準確的問題，提供一種新的羧甲基纖維素酶活力的測定方法，采用本專利技術(shù)的方法，測定過程簡便快速，測定現(xiàn)象清晰明了，測定結(jié)果準確可靠。本專利技術(shù)是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的，包括如下步驟(I)猴頭菌培養(yǎng)物溶液的制備猴頭菌培養(yǎng)物經(jīng)粉碎，過篩，以適量水溶解，振搖 2^4小時，濾過，定容。(2)吸光度測定精密量取1%羧甲基纖維素鈉溶液1. 5ml置具塞刻度試管中，精密加猴頭菌培養(yǎng)物溶液O. 5ml，混勻，置45飛5°C水浴中保溫25 35分鐘，取出，立即精密加入DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置廣2小時，以空白管進行調(diào)零，在540nm波長處測定吸光度。空白管加1% 羧甲基纖維素鈉溶液1. 5ml，置45飛5°C水浴中保溫25 35分鐘，取出，精密加猴頭菌培養(yǎng)物溶液O. 5ml，混勻，立即精密加入DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置廣2小時。(3)計算羧甲基纖維素酶活力從葡萄糖標準曲線上讀出猴頭菌培養(yǎng)物溶液中還原糖的重量(mg)，按照下式計算羧甲基纖維素酶活力U=AX 1/0. 5XnX2式中U——每Ig含酸性羧甲基纖維素酶活力單位，U/g ;A——吸光度在標準曲線上查得的還原糖重量，mg ；η——樣品稀釋倍數(shù)；2——時間換算系數(shù)。Ig固體酶在50±1°C、pH4. 8條件下，I小時水解1%羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生出相當于I mg葡萄糖的還原糖量為一個酸性羧甲基纖維素酶活力單位，以U/g表示。上述的羧甲基纖維素酶活力的測定方法，其中步驟(3)所述的葡萄糖標準曲線測繪方法為:分別精密量取O. 2 mg/ml、0· 4 mg/ml、0. 6 mg/ml、0. 8 mg/ml、1. Omg/ml 的葡萄糖對照品溶液1. 5ml，置具塞刻度試管中，各精密加pH4. 8檸檬酸鹽緩沖液O. 5ml，混勻，立即精密加入DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5 15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘， 再加水至刻度，搖勻，靜置廣2小時，以相應的試劑為空白，在540nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，葡萄糖量為橫坐標，繪制標準曲線。上述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其中上述具塞刻度試管容積為25ml。上述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其中上述猴頭菌培養(yǎng)物溶液為8 10 mg/ml, 且臨用新制。 上述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其中上述羧甲基纖維素鈉溶液的配置方法是精密稱取1. Og羧甲基纖維素鈉，置具塞錐形瓶中，精密加入pH4. 8檸檬酸鹽緩沖液80ml，稱定重量，85±5°C邊加熱邊磁力攪拌至完全溶解，放冷，再稱定重量，用pH4. 8檸檬酸鹽緩沖液補足減失的重量，搖勻，以3mol/l鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4. 8，轉(zhuǎn)移至IOOml 量瓶中，加PH4. 8檸檬酸鹽緩沖液至刻度，搖勻，即得1%羧甲基纖維素鈉溶液。上述的羧甲基纖維素酶活力的測定，其中上述DNS試劑的配置方法是取結(jié)晶酚 6. 9g，加10%氫氧化鈉溶液15ml溶解后，加水稀釋至70ml，搖勻，再加入6. 9g亞硫酸氫鈉， 即得DNS甲液。取酒石酸鉀鈉255g，加10%氫氧化鈉溶液300ml溶解后，再加入1%3，5- 二硝基水楊酸880ml，搖勻，即得DNS乙液。取上述甲液與乙液混合，搖勻，置玻璃塞的棕色玻瓶中，4°C放置7天后使用。本專利技術(shù)的測定方法是經(jīng)過考察顯色劑用量、顯色時間、靜置時間、羧甲基纖維素鈉底物濃度、酶促反應溫度、酶促反應時間、酶液稀釋度等猴頭菌培養(yǎng)物活性成分酸性羧甲基纖維素酶活力測定的影響因素，以及該測定方法的精密度與適應性，最終確立的酸性羧甲基纖維素酶活力的測定方法。采用本專利技術(shù)進行酸性羧甲基纖維素酶活力的測定，測定方法簡便快速，測定現(xiàn)象清晰明了，測定結(jié)果準確可靠。顯色劑DNS試劑用量對吸光度測定的影響精密量取O. 5mg/ml葡萄糖標準溶液1. 5ml置25 ml具塞刻度試管中，精密加入pH4. 8檸檬酸鹽緩沖液O. 5ml及不同體積的DNS 試劑，搖勻，置沸水浴中保溫30分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻， 靜置1. 5小時，在540nm波長處測定吸光度，結(jié)果如表I、附圖說明圖1所示。表I顯色劑用量對吸光度測定的影響體積(.ml)0.50.71.01.21.51.72.0540nm吸光度0.1470.1940.2780.32603670.3760.381結(jié)果表明，當顯色劑DNS試劑用量小于1. 5ml時，吸光度隨顯色劑用量的增加而增大，當顯色劑用量大于1. 5ml時，吸光度則基本保持不變。因此，顯色劑DNS試劑的最適用量為1. 5ml。顯色時間對吸光度測定的影響精密量取O. 5mg/ml葡萄糖標準溶液1. 5ml置25 ml具塞刻度試管中，精密加入pH4. 8檸檬酸鹽緩沖液O. 5ml及DNS試劑1. 5ml，搖勻，置沸水浴中保溫不同時間，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置1. 5小時， 在540nm波長處測定吸光度，結(jié)果如表2、圖2所示。表2顯色時間對吸光度測定的影響時間Cmin)I3571012151720540ηηι吸光度0.1730.2870.3560.3680.3780.3840.3910.3920.392本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種羧甲基纖維素酶活力的測定方法，包括如下步驟：（1）猴頭菌培養(yǎng)物溶液的制備：猴頭菌培養(yǎng)物經(jīng)粉碎，過篩，以適量水溶解，振搖2~4小時，濾過，定容。（2）吸光度測定：精密量取1%羧甲基纖維素鈉溶液1.5ml置具塞刻度試管中，精密加猴頭菌培養(yǎng)物溶液0.5ml，混勻，置45~55℃水浴中保溫25~35分鐘，取出，立即精密加入DNS試劑1.5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5~15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置1~2小時，以空白管進行調(diào)零，在540nm波長處測定吸光度。空白管加1%羧甲基纖維素鈉溶液1.5ml，置45~55℃水浴中保溫25~35分鐘，取出，精密加猴頭菌培養(yǎng)物溶液0.5ml，混勻，立即精密加入DNS試劑1.5ml，搖勻，置沸水浴中保溫5~15分鐘，取出，迅速自來水冷卻10分鐘，再加水至刻度，搖勻，靜置1~2小時。（3）計算羧甲基纖維素酶活力：從葡萄糖標準曲線上讀出猴頭菌培養(yǎng)物溶液中還原糖的重量（mg），按照下式計算羧甲基纖維素酶活力：U=A×1/0.5×n×2式中?U——每1g含酸性羧甲基纖維素酶活力單位，U/g；A——吸光度在標準曲線上查得的還原糖重量，mg；n——樣品稀釋倍數(shù)；2——時間換算系數(shù)。1g固體酶在50±1℃、pH4.8條件下，1小時水解1%羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生出相當于1?mg葡萄糖的還原糖量為一個酸性羧甲基纖維素酶活力單位，以U/g表示。...
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何述金，常耀臺，賈林，周代俊，周準，
申請(專利權(quán))人：何述金，
類型：發(fā)明
國別省市：
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