用于檢測黃瓜疫霉的LAMP引物及含有該引物的試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種用于檢測黃瓜疫霉（Phytophthora?melonis）的LAMP引物及含有該引物的試劑盒，所述引物包括FIP和BIP以及F3和B3（如Seq?ID?No.1-4所示）。本發(fā)明專利技術(shù)將LAMP引物恒溫擴增技術(shù)用于黃瓜疫霉病菌的快速檢測，可從發(fā)病植物組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境準確地檢測出黃瓜疫霉。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR方法更高，可對黃瓜疫霉的各種形態(tài)的繁殖體如菌絲、卵孢子和游動孢子等進行檢測，對黃瓜疫霉疫情的早期預(yù)警、疫區(qū)的病原監(jiān)測等方面具有重要意義；同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及黃瓜疫霉的檢測，具體地說，涉及用于檢測黃瓜疫霉的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。
技術(shù)介紹
植物病原卵菌是一類重要的植物病原菌，可侵染危害多種植物，導(dǎo)致多種植物的毀滅性病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P. capsici )、大豆疫霉(P. sojae)、寄生疫霉(P. parasitic)、樟疫霉(P. cinnamomi)及冬生疫霉(P. hibemalis)分別引起馬鈴薯、辣椒、大豆、煙草、樟樹及柑橘的重要疫病，嚴重年份乃至絕產(chǎn)。該類病菌主要以菌絲體或卵孢子在病殘體或土壤中渡過不良環(huán)境而作為初侵染源，在適宜條件下，菌絲體或卵孢子均可萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊-釋放游動孢子，再借助雨水或氣流進行傳播、侵染而導(dǎo)致植物病害。因此，對該類病菌的初侵源或侵染寄主早期進行適時監(jiān)控，利于控制病害的 發(fā)生，傳統(tǒng)的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態(tài)調(diào)控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發(fā)乃至產(chǎn)生明顯危害時才實施，忽視了對初侵染源或侵染寄主早期適時采取綜合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最終很難控制病害的發(fā)生與流行。黃瓜疫霉(P. melonis)是我國乃至亞洲常見黃瓜病害種類，多在溫室等低溫高濕低光照環(huán)境下侵染黃瓜(Cucumis sativus),造成黃瓜根腐病，導(dǎo)致生產(chǎn)損失，此病還在臺灣地區(qū)、日本和韓國等地也均有報道。此外，黃瓜疫霉在亞洲地區(qū)也有侵染西瓜(CitrullusIanatus,韓國)、香瓜(Cucumis melo,韓國和日本)開心果(Pistacia vera,伊朗)、異株括樓(Trichosanthes dioica,印度)等多種作物的報道。因此，它是我國和亞洲地區(qū)的重要作物病害，開發(fā)黃瓜疫霉的早期快速檢測技術(shù)，對相關(guān)作物生產(chǎn)中的病害防控和無公害化具有重要的意義。近年來，PCR技術(shù)及其相關(guān)分子檢測技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長動態(tài)的分子檢測與預(yù)警，主要利用核糖體rDNA/ITS序列設(shè)計特異性引物來對植物致病菌進行快速檢測。ITS+5. 8S區(qū)域由編碼真核細胞rRNA 5. 8S亞基的基因和該基因兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄間序列(InterTranscribedSpacer, ITS)組成，由于ITS+5. 8S區(qū)域具有較高的變異速率，因此常被用于真菌種水平的鑒定和分子系統(tǒng)學(xué)研究。目前大多采用常規(guī)PCR方法進行植物病原菌檢測，對儀器設(shè)備(如PCR儀、凝膠成像系統(tǒng))要求高，投入大，給技術(shù)的基層推廣造成了極大障礙。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種便于基層推廣使用的，用于檢測黃瓜疫霉的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。為了實現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的一種用于檢測黃瓜疫霉(Phytophthora melonis)的LAMP引物組，其包括外側(cè)正向引物F3 :5 ’ -CGGCGACTGGCTGCTA-3 ’ ；外側(cè)反向引物B3 :5 ’ -ATTACGTATCGCAGTTCGCA-3 ’ ；以及內(nèi)側(cè)正向引物 FIP : 5 ’ -CAAGAATGGGTTTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGTTTGGG-3，；內(nèi)側(cè)反向引物 BIP :5’ -TTACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTTTCCTAGACATCCACTGCTGAAAG-3，。本專利技術(shù)還提供含有上述LAMP引物組的用于檢測黃瓜疫霉的試劑盒，其中所述試劑盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。前述試劑盒中還包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。更優(yōu)選地，前述試劑盒還包括標準陽性模板。本專利技術(shù)進一步提供上述LAMP引物組或試劑盒在檢測黃瓜疫霉中的應(yīng)用，包括步驟1)提取樣品中的DNA ;2)以步驟I)中提取的DNA為模板，進行LAMP-PCR擴增反應(yīng)；3)分析PCR產(chǎn)物，即對上述擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳檢測結(jié)果判定樣品中是否含有黃瓜疫霉。LAMP-PCR反應(yīng)體系以40 ill計為本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
用于檢測黃瓜疫霉（Phytophthora?melonis）的LAMP引物組，其特征在于，其包括：外側(cè)正向引物F3：5’?CGGCGACTGGCTGCTA?3’；外側(cè)反向引物B3：5’?ATTACGTATCGCAGTTCGCA?3’；以及內(nèi)側(cè)正向引物FIP：5’?CAAGAATGGGTTTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGTTTGGG?3’；內(nèi)側(cè)反向引物BIP：5’?TTACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTTTCCTAGACATCCACTGCTGAAAG?3’。

【技術(shù)特征摘要】
1.用于檢測黃瓜疫霉(Phytophthoramelonis)的LAMP引物組,其特征在于,其包括 外側(cè)正向引物 F3 :5，-CGGCGACTGGCTGCTA-3，；外側(cè)反向引物 B3 :5’ -ATTACGTATCGCAGTTCGCA-3’ ；以及內(nèi)側(cè)正向引物 FIP :5’ -CAAGAATGGGITTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGITTGGG-3’ ；內(nèi)側(cè)反向引物 BIP :5’ -TTACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTTTCCTAGACATCCACTGCTGAAA G-3，。2.含有權(quán)利要求I所述LAMP引物組的用于檢測黃瓜疫霉的試劑盒。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫翔，郭良棟，季妞妞，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院微生物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：