本發明專利技術涉及基于通用熒光引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括下列步驟：（1）提供多重競爭性PCR引物，由至少一對待測區段引物和至少一對參照區段引物組成；（2）提供競爭性內對照模板，內對照模板序列與實際序列在序列中僅有一個堿基替換；（3）多重競爭性PCR反應；（4）LDR反應；和（5）數據分析。本發明專利技術還提供基于以上檢測方法的試劑盒，適用于5~25個基因/反應的拷貝數變異的檢測，是一種快速、中通量、經濟的拷貝數變異檢測方案。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，尤其涉及基于多重競爭性PCR以及LDR技術檢測拷貝數變異的方法，應用于生物科學研究與臨床分子診斷。
技術介紹
拷貝數變異(copy number variations, CNVs)是近年來發現的基因組多樣性的新形式，它是指與參考序列相比，基因組中lkb 3Mb的DNA片段的結構變異現象。CNVs廣泛存于基因組中，與一些遺傳性疾病的發生相關，對人類抗病性和易感性表型等變異有重要影響。這就要求建立一種快速、準確和低成本的CNVs分型檢測技術。隨著生物技術的發展，不同的研究小組相繼開發了許多的檢測方法，主要包括以雜交為基礎和以PCR為基礎的檢測技術。前者可以在全基因組水平上對CNVs進行檢測，代表技術有微陣列比較基因雜交(SolinasToldo, Lampel et al Genes Chromosomes Cancer. 1997Dec; 20 (4) : 399-407)、全基因組 SNP 芯片(Irving, Bloodworth et al. Cancer Res. 2005Aprl5; 65 (8) : 3053-8)、代表性寡核昔酸微陣列技術(Lucito, Healy et al. Genome Res. 20030ct; 13 (10) :2291-305. Epub2003Sepl5.)等，其優點是通量高且易于實現自動化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期長的缺點。后者主要是針對具體的目標位點進行檢測，代表性的技術有實時熒光定量PCR、多重連接探針擴增技術(MLPA) (Schouten, McElgunn et al. Nucleic Acids Res. 2002Junl5; 30 (12) : e57)和多重可擴增探針雜交(MAPH) (Armour, Sismani et al. Nucleic Acids Res. 2000Janl5; 28 (2) :605-9.) 等。實時熒光定量技術有操作簡單、重復性好、實驗周期短等優點，但是檢測通量較??；與實時熒光定量PCR相比，MLPA和MAPH的檢測通量有了很大提高，不過PCR微環境的變化會導致不同位點不能完全同步擴增，而且PCR的平臺效應也會影響檢測結果。以PCR為基礎的檢測技術存在一個共同的缺陷就是待測樣本和對照樣本是分開檢測的，這樣兩者PCR效率的差異會引起檢測結果的偏差。競爭性PCR克服了這個缺陷，實現CNVs的快速、準確、經濟的檢測。在PCR擴增過程中，PCR產物的量可以用公式Y=A (1+R) n來表示，其Y表示PCR產物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的擴增效率，η表示PCR的循環數，當PCR擴增效率相同時，PCR產物的量與初始模板的量成正比。競爭性PCR利用了這一原理，在同一 PCR反應體系中涉及兩組模板，一組是待測樣本，另一組是合成的一段核酸序列，用作內對照，兩組模板僅在目標序列長度上(存在一些堿基的插入或缺失)存在一些差異，其他反應條件一致，因此兩者擴增效率接近一致，兩種擴增產物量的比直觀的反映了初始模板(待測樣本和內對照不存在拷貝數差異)量的比，可以根據內對照的初始模板的量來計算待測樣本的濃度。在檢測拷貝數變異時，當兩模板具有相同的濃度或消除了濃度差異帶來的影響時，PCR產物量的比值就反映模板拷貝數的差異。PRT 法(Paralogue Ratio Test) (Armour, Palla et al. Nucleic Acids Res. 2007; 35 (3) :el9. Epub2006Decl4)是基于競爭性PCR 的一種檢測 CVNs 的一種方法，此方法的優點是待測位點和內對照共存于基因組序列中，但是缺點也是很明顯的，只能針對有限的基因位點進行檢測，而且針對不同檢測位點都要設計一對熒光引物，加大了實驗成本。對于一些基于多重競爭性PCR的定量技術，因為其PCR產物的長度必須能清晰分離，這對PCR產物的設計提出了較高的要求。對于一些PCR產物長度相近的情況則無法進行檢測。本專利技術就是利用LDR技術，對PCR產物的長度不提出要求，解決了多重PCR設計的難點。
技術實現思路
所要解決的技術問題本專利技術要解決的技術問題是克服現有技術一些多重競爭性PCR產物長度設計難點的問題，提供一種成本低、通量高、樣本需求低、檢測靈敏性高、普及度廣的CNVs檢測方法。技術方案在總結現有技術中各種檢測方法的優缺點基礎上，專利技術人經過自主創新研發，令人驚奇地發現通過如下設計，可以成功解決上述技術問題，并且成功應用于生物科學研究與臨床分子診斷等領域。本專利技術的目的通過以下技術方案實現本專利技術的技術方案之一是提供一種多重競爭性PCR和LDR聯合檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟(I)提供多重競爭性PCR引物所述的多重競爭性PCR引物由分別針對待測區段和參照區段設計的至少一對待測區段引物和至少一對參照區段引物組成，TM值> 62°C，長度范圍為18飛Obp，所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段間的長度差異沒有要求；(2)提供內對照序列通過全基因合成法合成一條與所述多重競爭性PCR的擴增產物片段之一相比僅一個替換堿基的差異的序列，且所述替換堿基的位置不在引物結合區；或者通過載體克隆法將PCR產物克隆到質粒上，并在某個堿基上導入替換突變，且所述替換突變的堿基的位置不在引物結合區；(3)多重競爭性PCR反應將含待測區段和參照區段的待測樣本和對照樣本分別與所述內對照的稀釋液混合在一起，所述待測樣本和所述對照樣本的DNA分子數分別與所述內對照稀釋液的DNA分子數相差10倍范圍內，進行多重競爭性PCR反應；(4)多重LDR測序反應取所述多重競爭性PCR反應的產物與含所述測序探針的 LDR反應體系混合，進行LDR測序反應；(5) LDR測序產物電泳分離對所述LDR測序反應的產物進行電泳分離，利用LDR 測序反應將單堿基差異轉變成序列長度差異的原理將所述待測樣本或所述對照樣本分別與內對照產物區分開、且利用LDR測序產物的濃度和模板濃度成線性關系的原理，通過檢測LDR測序產物在電泳分離后的濃度分別獲得所述待測樣本、所述對照樣本、和所述內對照所對應的各個模板的相對濃度，所述的相對濃度以電泳分離片段的峰高和/或峰面積表示；(6)數據分析i.將每個待測區段和參照區段的峰高和/或峰面積(S)和內對照的峰高和/或峰面積(I)作比，得到每個待測區段和參照區段的比值(S/I); 以一個參照區段的比值為標準，將其他待測區段和參照區段的比值分別同其作比，進行數據內部標化；iii.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比，獲得待測樣本與對照樣本的比值，該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數。上述技術方案的優選方式之一為，所述待測區段引物和所述參照區段引物的長度范圍均為38 45bp。上述技術方案的優選方式之二為，所述多重PCR引物對應的擴增產物的長度范圍為 120 1000bp。上述技術方案的優選方式之三為，所述LDR測序探針對應的產物的長度范圍為 70 200bp。上述技術方案的優選方式之四為，所述的多重競爭性PCR引物含一到二十五對針對不同待測基因的待測區段引物。作為另一種具體實施方式，所述的多重競爭性PCR引物本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多重競爭性PCR和LDR聯合檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟：（1）提供多重競爭性PCR引物：所述的多重競爭性PCR引物由分別針對待測區段和參照區段設計的至少一對待測區段引物和至少一對參照區段引物組成，TM值≥62℃，長度范圍為18~50bp，所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段間的長度差異沒有要求；（2）提供內對照序列：通過全基因合成法合成一條與所述多重競爭性PCR的擴增產物片段之一相比僅一個替換堿基的差異的序列，且所述替換堿基的位置不在引物結合區；或者通過載體克隆法將PCR產物克隆到質粒上，并在某個堿基上導入替換突變，且所述替換突變的堿基的位置不在引物結合區；（3）多重競爭性PCR反應：將含待測區段和參照區段的待測樣本和對照樣本分別與所述內對照的稀釋液混合在一起，所述待測樣本和所述對照樣本的DNA分子數分別與所述內對照稀釋液的DNA分子數相差10倍范圍內，進行多重競爭性PCR反應；（4）多重LDR測序反應：取所述多重競爭性PCR反應的產物與含所述測序探針的LDR反應體系混合，進行LDR測序反應；（5）LDR測序產物電泳分離：對所述LDR測序反應的產物進行電泳分離，利用LDR測序反應將單堿基差異轉變成序列長度差異的原理將所述待測樣本或所述對照樣本分別與內對照產物區分開、且利用LDR測序產物的濃度和模板濃度成線性關系的原理，通過檢測LDR測序產物在電泳分離后的濃度分別獲得所述待測樣本、所述對照樣本、和所述內對照所對應的各個模板的相對濃度，所述的相對濃度以電泳分離片段的峰高和/或峰面積表示；（6）數據分析i.將每個待測區段和參照區段的峰高和/或峰面積（S）和內對照的峰高和/或峰面積（I）作比，得到每個待測區段和參照區段的比值（S/I）；ii以一個參照區段的比值為標準，將其他待測區段和參照區段的比值分別同其作比，進行數據內部標化；iii.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比，獲得待測樣本與對照樣本的比值，該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數。...
【技術特征摘要】
1. 一種多重競爭性PCR和LDR聯合檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟 (1)提供多重競爭性PCR引物所述的多重競爭性PCR引物由分別針對待測區段和參照區段設計的至少一對待測區段引物和至少一對參照區段引物組成，TM值> 62°C，長度范圍為18飛Obp，所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段間的長度差異沒有要求； (2)提供內對照序列通過全基因合成法合成一條與所述多重競爭性PCR的擴增產物片段之一相比僅一個替換堿基的差異的序列，且所述替換堿基的位置不在引物結合區；或者通過載體克隆法將PCR產物克隆到質粒上，并在某個堿基上導入替換突變，且所述替換突變的堿基的位置不在引物結合區； (3)多重競爭性PCR反應將含待測區段和參照區段的待測樣本和對照樣本分別與所述內對照的稀釋液混合在一起，所述待測樣本和所述對照樣本的DNA分子數分別與所述內對照稀釋液的DNA分子數相差10倍范圍內，進行多重競爭性PCR反應； (4)多重LDR測序反應取所述多重競爭性PCR反應的產物與含所述測序探針的LDR反應體系混合,進行LDR測序反應； (5)LDR測序產物電泳分離對所述LDR測序反應的產物進行電泳分離，利用LDR測序反應將單堿基差異轉變成序列長度差異的原理將所述待測樣本或所述對照樣本分別與內對照產物區分開、且利用LDR測序產物的濃度和模板濃度成線性關系的原理，通過檢測LDR測序產物在電泳分離后的濃度分別獲得所述待測樣本、所述對照樣本、和所述內對照所對應的各個模板的相對濃度，所述的相對濃度以電泳分離片段的峰高和/或峰面積表示； (6)數據分析 1.將每個待測區段和參照區段的峰高和/或峰面積(S)和內對照的峰高和/或峰面積(I)作比，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陸炯，肖君華，陳軼群，
申請(專利權)人：上海翼和應用生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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