酶法制備谷胱甘肽的方法技術

本發明專利技術提供一種酶法制備谷胱甘肽（GSH）的方法，該方法將合成GSH的兩步反應，即生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反應和生成GSH的反應，分別在不同的反應罐中進行，并且每步反應之后都分離出反應使用的酶即γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH-I）和谷胱甘肽合成酶（GSH-II），使得GSH?I和GSH?II兩種酶的酶活力得到最大程度利用，降低了兩種酶促反應之間的相互抑制。本發明專利技術方法實現了GSH?I和GSH?II的循環利用，并且使用了適合制備GSH的反應所需的ATP再生系統，降低了制備GSH的生產成本，提高了GSH產率，實現了大規模連續生產，經濟效益顯著。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及制備谷胱甘肽的方法，尤其涉及一種。
技術介紹
谷胱甘肽廣泛存在于動植物和微生物中，是生物體內最重要的非蛋白巰基化合物之一，具有還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物體內大量存在并起主要作用的是GSH，廣泛用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內分泌疾病，并作為生物活性添加劑及抗氧化劑用于食品領域。GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)通過肽鍵形成，分子中有一特殊的Y肽鍵，即由谷氨酸的Y-COOH與半胱氨酸的α-ΝΗ2縮合成的肽鍵，它不同于蛋白質分子中的普通肽鍵。GSH為白色晶體，易溶于水、低濃度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。 兩分子GSH脫氫后以二硫鍵相連形成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，又稱谷胱甘肽二硫化物，多以水合物形式存在，是溶于水的白色晶體。目前谷胱甘肽的主要制備方法有溶劑萃取法、化學合成法、生物發酵法和酶法。 從谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有機溶劑污染嚴重、純度不高，而且消耗大量糧食，現已很少使用。化學合成法合成GSH，由于活性產物不易分離，需要化學拆分，產品純度不高，難以推廣。近年頗受重視的是將編碼GSH合成酶系的基因克隆到大腸桿菌或酵母中，使用微生物發酵生產GSH。酵母發酵法，工藝較成熟，但產量有待提高，而且下游工藝處理復雜。與三磷酸腺苷(ATP)再生體系偶聯合成GSH，乙酰激酶盡管效率較高，但乙酰磷酸的高價格及穩定性限制了此法的產業化；酵母糖酵解途徑成本低廉，雖在胞二磷膽堿和NADP的合成方面獲得成功，但合成GSH的效率較低，主要是ATP再生反應效率不高，反應條件與GSH酶系催化合成GSH的條件不協調以及由此造成的成本較高限制了此方法潛力的發揮。近年來國內外GSH生產基本采用發酵法，酶法生產GSH的技術還未成形。有研究者提出用固定化酶技術生產GSH，通過調節GSH I和GSH II兩種酶的比例，將兩種酶固定在載體上，通過加入底物和ATP來生產GSH。但是該方法存在以下問題，直接限制了該技術的工業化應用I) GSH I和GSH II兩種酶固定在一起，無法解決兩步反應之間的相互抑制，影響了生產速度；2)固定化酶技術未解決酶活性的穩定性問題，提高了生產酶的成本；以及3)酶法合成的最大問題是ATP的來源，由于ATP價格昂貴，使得利用酶法合成GSH 的成本比傳統發酵法高很多。
技術實現思路
本專利技術的目的在于克服現有技術的不足，提供一種大規模、低成本、工業化生產 GSH的方法，解決目前酶法生產GSH存在的問題。本專利技術提供了一種，包括以下步驟(I)在反應罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸；(2)在過濾器El中分離GSH I酶；(3)在反應iip B中生成谷胱;甘妝；(4)在過濾器Ε2中分離GSH II酶；以及(5)分尚產物 GSH。本專利技術方法進一步包括以下步驟(6)在再生罐C中利用二磷酸腺苷(ADP)和/或磷酸腺苷(AMP)再生ΑΤΡ，并分離生成的ATP。本專利技術方法還可進一步包括以下步驟(7)所述步驟(2)中分離的GSH I酶的循環利用，即將分離的GSH I酶添加至反應罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的連續反應；以及(8) GSH I酶的連續分離，即在過濾器El中連續分離GSH I酶。本專利技術方法還可進一步包括以下步驟(9)所述步驟(4)中分離的GSH II酶的循環利用，即將分離的GSH II酶添加至反應罐B中生成谷胱甘肽的連續反應；以及(10) GSH II酶的連續分離，即在過濾器Ε2中連續分離GSH II酶。本專利技術方法還進一步包括以下步驟(11)產物GSH的連續分離。在本專利技術方法中，循環利用GSH I酶和GSH II酶、以及再生ATP至少一次，即重復所述步驟(6)至所述步驟(11)至少一次，優選重復多次，例如重復2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、25、30、40、50 次等。本專利技術方法中，在反應罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的反應如下反應溫度為25_60°C，優選30-55°C，更優選35_50°C，最優選37-45°C ；反應PH為5-10，優選6-10，更優選7-9的條件下；反應體系I為含有底物谷氨酸或其鹽和半胱氨酸或其鹽、以及鎂離子、鉀離子、鈉離子和Tris的水溶液；在反應體系I中添加ATP和GSH I酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHI酶，反應一段時間，例如1-10小時,優選2-8小時,最優選3-6小時生成Y-谷氨酰半胱氨酸；其中所述鎂離子源自氯化鎂、硫酸鎂、亞硫酸鎂或硝酸鎂中的一種或多種；所述鉀離子源自氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、氫氧化鉀、亞硫酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、醋酸鉀或檸檬酸鉀中的一種或多種；所述鈉離子源自氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、碳酸鈉、 碳酸氫鈉、醋酸鈉或檸檬酸鈉中的一種或多種。本專利技術方法中在反應罐B中生成谷胱甘肽的反應如下反應溫度為25-60°C，優選30-55°C，更優選35_50°C，最優選37-45°C ；反應PH為5-10，優選6-10，更優選7-9的條件下；反應體系2為添加了底物甘氨酸或其鹽的所述步驟(2)的濾出液I ;在反應體系2中添加ATP和GSH II酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHII酶， 反應一段時間，例如1-10小時，優選2-8小時，最優選2-5小時生成谷胱甘肽。本專利技術方法中在再生罐C中的再生反應如下反應溫度為25_50°C，優選 25_40°C ；反應 PH 為 4-9，優選 5-8 ；再生反應體系為包含葡萄糖、酵母、鎂離子、鉀離子、鈉離子和磷酸根離子的水溶液；向再生罐C中添加的ADP和/或AMP為所述步驟(5)分離出產物GSH之后的反應液的濃縮液；在再生罐C反應一段時間生成再生的ATP，再生的ATP通過離心或過濾方法分離；其中所述酵母選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或畢赤酵母 (Pichia pastoris)，所述磷酸根離子源自磷酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或磷酸鈉或磷酸鉀中的一種或多種。本專利技術方法中過濾器El或E2具有進料口、出料口和回流口，內設過濾膜，在循環利用GSH I酶或GSH II酶時，反應體系通過過濾器El或E2添加至反應罐的方式如下向反應罐A或反應罐B中添加完分離的GSH I酶或GSH II酶之后，將補加的反應體系I的反應液或反應體系2的反應液經過濾器El或過濾器E2的回流口、過濾器El或 E2、和過濾器El或E2的進料口添加至反應罐A或反應罐B。本專利技術方法中所提及的氨基酸或其鹽都為L型氨基酸或其鹽。更具體地，本專利技術方法包括以下步驟(I)在反應罐A中生成Y -谷氨酰半胱氨酸(Y -GluCys )在反應體系I中添加ATP和GSH I酶，在25_60°C、PH為5-10的條件下反應生成 Y-谷氨酰半胱氨酸，其中所述反應體系I為含有底物谷氨酸或其鹽和半胱氨酸或其鹽、以及鎂離子、鉀離子、鈉離子和Tris的水溶液；(2)在過濾器El中分離GSH I酶通過超濾方法，從所述步驟(I)的反應體系I的反應液中分離出GSH I酶，經過濾器El的濾出液I為分離出GSH I酶之后的反應體系I的反應液，其中所述過濾器El具有進料口、出料口和回流口，內設截留分子量小于56kDa的膜；(3)本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種酶法制備谷胱甘肽的方法，包括以下步驟：（1）在反應罐A中生成γ?谷氨酰半胱氨酸；（2）在過濾器E1中分離GSH?I酶；（3）在反應罐B中生成谷胱甘肽；（4）在過濾器E2中分離GSH?II酶；以及（5）分離產物GSH。

【技術特征摘要】
1.ー種酶法制備谷胱甘肽的方法，包括以下步驟 (1)在反應罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸； (2)在過濾器El中分離GSHI酶； (3)在反應B中生成谷胱;甘妝； (4)在過濾器Ε2中分離GSHII酶；以及 (5)分離產物GSH。2.根據權利要求I所述的方法，進ー步包括以下步驟 (6)在再生罐C中利用ADP和/或AMP再生ΑΤΡ，并分離生成的ΑΤΡ。3.根據權利要求I或2所述的方法，進ー步包括以下步驟 (7)所述步驟(2)中分離的GSHI酶的循環利用，即將分離的GSH I酶添加至反應罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的連續反應；以及 (8)GSH I酶的連續分離，即在過濾器El中連續分離GSH I酶。4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，進ー步包括以下步驟 (9)所述步驟(4)中分離的GSHII酶的循環利用，即將分離的GSH II酶添加至反應罐B中生成谷胱甘肽的連續反應；以及 (10)GSHII酶的連續分離，即在過濾器Ε2中連續分離GSH II酶。5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，進ー步包括以下步驟 (11)產物GSH的連續分離。6.根據權利要求5所述的方法，循環利用GSHI酶和GSH II酶、以及再生ATP至少ー次，即重復所述步驟(6)至所述步驟(11)至少一次，優選重復多次，例如重復2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50 次等。7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，在反應罐A中生成Y-谷氨酰半胱氨酸的反應如下 反應溫度為25-60°C，優選30-55°C，更優選35_50°C，最優選37-45°C ； 反應PH為5-10，優選6-10，更優選7-9的條件下； 反應體系I為含有底物谷氨酸或其鹽和半胱氨酸或其鹽、以及鎂離子、鉀離子、鈉離子和Tris的水溶液； 在反應體系I中添加ATP和GSH I酶，或者添加再生的ATP和分離的GSHI酶，反應ー段時間生成Y-谷氨酰半胱氨酸； 其中所述鎂離子源自氯化鎂、硫酸鎂、亞硫酸...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉珊珊，秦永發，
申請(專利權)人：北京天開易達生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：