一種酶促法生產1,6-二磷酸果糖的方法技術

本分案申請公開了一種酶促法生產1,6

【技術實現步驟摘要】
一種酶促法生產1,6
?
二磷酸果糖的方法
[0001]本申請是申請日為2017年6月15日、申請號為201710453365.3、專利技術名稱為“一種利用腺苷代替ATP進行酶促反應的生產方法”的專利申請的分案申請。


[0002]本專利技術涉及生物
，特別涉及一種利用腺苷代替ATP進行酶促反應的生產方法，具體涉及一種酶促法生產1,6
?
二磷酸果糖的方法。

技術介紹

[0003]三磷酸腺苷(ATP)由一個腺苷和三個磷酸基團組成，分子量為507，分子式C
10
H
16
N5O
13
P3。它是生物能量的轉換器和貯存器，在利用和轉換能量的酶促反應中，起著不可替代的重要作用。
[0004]由于目前ATP成本偏高，在工業生產中直接使用ATP進行酶促反應收益甚微。因此，能夠在反應生產中投入少量的ATP，通過建立穩定、有效的ATP再生體系，使ATP在反應過程中循環利用是目前利用ATP進行工業化生產的研究方向。
[0005]工業上ATP再生常用的方法是利用酵母菌的糖酵解途徑，進行底物水平磷酸化方式再生ATP。此法參與催化反應的酶眾多，反應過程復雜，反應過程不易控制，產品批次間質量差異較大。同時酵母酶系質量常因供應的廠家不同、批次不同、甚至季節不同而有很大差異。另外反應過程需要加入大量的酵母細胞酶液，引入了許多蛋白、色素等雜質給后期純化帶來一定困難。近年來，ATP再生的研究重點轉向使用單一酶或較簡單的酶系，獲得高效穩定的再生效果。其中，乙酸激酶、氨激酶、丙酮酸激酶等酶均可有效再生ATP。但是，這些酶所利用的底物價值昂貴，如丙酮酸激酶所利用的磷酸烯醇式丙酮酸；且生成的副產物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激酶、氨激酶催化反應的產物分別為乙酸和氨氣，因此較難在工業生產中大量使用。
[0006]專利CN201610268246.6利用多聚磷酸或其鹽作為磷酸和能量供體，使用多聚磷酸激酶(PPK，EC 2.7.4.1)、腺苷酸激酶(ADK，EC 2.7.4.3)和多聚磷酸
?
腺苷酸磷酸轉移酶(PAP，EC 2.7.4.
?
，有文獻報道該酶也屬于PPK酶中的一類，但IUBMB對該酶分類尚不十分明確)三種“ATP再生酶”合理組合，再生ATP，并應用于多種需ATP的酶促反應。此方法反應底物價格相對低廉，產物污染較小，適用于工業化生產。但使用此方法仍需加入一定量的ATP進行酶促反應。

技術實現思路

[0007]本專利技術提供了一種利用腺苷代替ATP進行酶促反應的生產方法，具體為一種酶促法生產1,6
?
二磷酸果糖的方法，該方法可進一步降低生產成本，即在原有含有ATP再生酶的反應體系中添加腺苷激酶(AK，EC 2.7.1.20)，該酶可催化腺苷生成AMP，組合上述其它ATP再生酶，可不使用ATP，僅添加少量腺苷即可進行酶促反應，是該領域一項重大革新。
[0008]本專利技術所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：
[0009]一種利用腺苷代替ATP進行酶促反應的生產方法，所述酶促反應為需要ATP的酶促反應，包括以下步驟：
[0010](1)在酶促反應體系中，按比例添加ATP再生酶、AK酶以及腺苷進行酶促反應：
[0011]通過基因工程改造、發酵、純化獲得ATP再生酶和AK酶，或以自然提取等其它方式獲得ATP再生酶和AK酶。ATP再生酶和AK酶可以游離酶的形式制成酶液或者干粉；也可進一步固定于固定化載體上，制得固定化ATP再生酶和AK酶。
[0012]在酶促反應體系中，按比例添加ATP再生酶和AK酶，并添加腺苷代替ATP進行酶促反應。其中所述反應體系為含有腺苷、多聚磷酸或其鹽以及鎂離子和錳離子的一種或兩種的水溶液。另外，反應體系中還可包含鉀離子、鈉離子、銨離子的一種或幾種，Tris和磷酸根離子的一種或幾種。本專利技術添加的底物、酶及各類鹽可一次性加入反應體系，也可按照工業生產工藝流程分批次流加補入。
[0013](2)固定化的ATP再生酶和AK酶在反應罐中直接分離，游離的ATP再生酶和AK酶通過過濾器中超濾膜分離：
[0014]固定化的ATP再生酶和AK酶在反應罐中直接分離。上述分離可通過濾袋分離，也可在反應柱中直接分離。或
[0015]游離的ATP再生酶和AK酶通過濾器中超濾膜分離。其中，過濾器具有進料口、出料口和回流口，內設截留的超濾膜。經過濾器的截留液為回收的酶液，濾出液為分離出酶之后含產物的反應液。
[0016](3)將步驟(2)濾出液進行分離、純化，獲得產物。
[0017]優選地，上述技術方案中，所述方法還包括以下步驟：
[0018](4)回收ATP再生酶和AK酶，并重復利用于步驟(1)中進行反應；
[0019](5)反應生成的少量ATP、ADP或AMP通過過濾或離子交換方法分離，生產ATP；或回收ATP、ADP或AMP，并重復利用于步驟(1)中進行反應。
[0020]優選地，上述技術方案中，所述步驟(1)中，ATP再生酶和AK酶為固定化酶或游離酶，AK酶濃度為0.01
?
8000U/L，其中將1μM底物在1分鐘內完全轉化定義為1個活性單位(U)；ATP再生酶為多聚磷酸激酶(PPK)、腺苷酸激酶(ADK)和多聚磷酸
?
腺苷酸磷酸轉移酶(PAP)的任意兩種或三種組合，即使用PPK和ADK組合，或ADK和PAP組合，或PPK和PAP組合，或PPK、ADK和PAP的組合；酶添加量PPK酶濃度為0.01
?
5000U/L，ADK酶濃度為0.01
?
5000U/L，PAP酶濃度為0.01
?
5000U/L。上述的ATP再生酶和AK酶可來源于任何生物，或者是經過人工改造具有同樣催化功能的酶。
[0021]優選地，上述技術方案中，所述步驟(1)的反應條件如下：
[0022]反應溫度為25
?
60℃，優選溫度為30
?
50℃；
[0023]反應pH為5
?
10，優選pH為6
?
9；
[0024]反應體系包括：腺苷；多聚磷酸或其鹽；鎂離子、錳離子中的一種或兩種組合；
[0025]在酶促反應體系中，按比例添加ATP再生酶和AK酶，進行酶促反應。
[0026]優選地，上述技術方案中，所述步驟(1)的反應還包括：
[0027]銨離子、鉀離子或鈉離子的一種或幾種組合；Tris或磷酸根離子的一種或兩種組合；其中，鉀離子濃度為0.01
?
0.5M；鈉離子濃度為0.01
?
0.5M；銨離子濃度為0.01
?
0.3M；Tris濃度為0.01
?
0.1M；磷酸鹽濃度為0.01
?
0.1M。
[0028]優選地，上述技術方案中，所本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種酶促法生產1,6
?
二磷酸果糖的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)催化用酶、ATP再生酶和AK酶的固定：催化用酶果糖激酶(FK)和磷酸果糖激酶(PFK)，同初步純化的ADK酶、PAP酶和AK酶一同以環氧基固定化載體LX1000EP固定；將FK、PFK、ADK、PAP和AK酶按照活性比2：2：1：1：1混合配成混合酶液，酶液中AK酶活性為2000U/L；在恒溫攪拌罐中加入LX1000EP濕載體2kg與上述酶液混合，在20℃條件下，150rpm攪拌12小時；過濾收集載體，用0.02M pH 8.0磷酸鉀緩沖液清洗2遍，即得固定化混合酶；(2)在反應柱中生成1,6
?
二磷酸果糖：配制反應液，每100L含有底物1....

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉珊珊，劉輝，周穩文，秦永發，
申請(專利權)人：北京天開易達生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：