本發明專利技術涉及微生物工程技術領域，具體提供了一種植酸酶，并構建了重組表達該植酸酶的黑曲霉工程菌株，保藏編號為CCTCC?NO:?M?2012502。該工程菌株能高效表達植酸酶，搖瓶發酵酶活為280U/mL。本發明專利技術重組表達的植酸酶可廣泛應用于飼料領域，提高養殖動物對磷的吸收能力，增加養殖效益，同時減少磷的排放，有利于環境保護。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于微生物工程
，具體涉及一種植酸酶及其重組表達工程菌株。
技術介紹
植酸酶(Phytase)即肌醇六憐酸水解酶(Myo-i-nositolhexaphosphatephosphohydrotase),是催化植酸以及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)的一類酶的總稱(黃遵錫，1999，食品與發酵工業)。植酸酶是一種糖蛋白，在植物、反芻動物、許多微生物包括酵母、霉菌、細菌中都能產生植酸酶。它能夠解除動物植物性飼料中植酸的抗營養作用，提高植物性飼料的營養價值。植酸酶作為一種新型飼料添加劑，在動物生產以及在環境保護中，都有重要的應用價值。然而植酸酶在天然材料中表達水平較低，加之天然植酸酶的某些生物學特性(如熱 穩定性，抗蛋白酶特性等)不能完全適合飼料加工的要求。隨著生物技術的飛速發展，采用基因工程的手段，使酶的高產優質成為可能，成為酸酶研究的熱點。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種植酸酶及其重組表達工程菌，通過構建含有植酸酶基因的表達載體，轉入黑曲霉(Aspergillus niger)中，獲得高效表達該植酸酶的黑曲霉工程菌株。本專利技術重組表達的植酸酶可廣泛應用于飼料領域，能有效提高養殖動物的生產性能和對磷的吸收能力，從而減少磷的排放量，增加養殖效益。本專利技術的植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO: I。用于編碼上述植酸酶的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。本專利技術涉及一種黑曲霉工程菌，為黑曲霉LH-KAspergillus niger LH-1)，該工程菌攜帶有能表達黑曲霉植酸酶基因的表達載體，已于2012年12月5日，保藏于位于武漢市武昌珞珈山武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO: M 2012502。本專利技術另一方面涉及上述黑曲霉工程菌的應用，用于生產植酸酶。本專利技術另一方面涉及上述植酸酶在飼料中的應用。本專利技術構建的黑曲霉工程菌能高效表達植酸酶，搖瓶發酵酶活為280U/mL。本專利技術重組表達的植酸酶能有效提高肉雞生產性能。在日糧中添加本專利技術重組表達的植酸酶，肉雞各期平均日增重、料肉比都優于對照組，并且優于國外某植酸酶產品。本專利技術的植酸酶能提高肉雞對磷的吸收能力，使磷的排泄量降低10. 7%以上，從而有利于增加養殖效益。附圖說明圖I :pVL_phy 質粒圖譜。圖2 :黑曲霉工程菌發酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指處即為重組表達的植酸酶。具體實施例方式以下實施例是為了更好地說明闡述本
技術實現思路
，本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本專利技術。但是，本專利技術的保護和權利要求范圍不限于所提供的案例。實施例I黑曲霉植酸酶基因的克隆I. I提取黑曲霉的總基因組DNA將黑曲霉過夜培養，取適量菌體置于離心管中，13000 rpm離心5 min，棄上清；力口A 400 u I 抽提緩沖液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min后，加入200 u LlOMNH 4AC,冰浴IOmin ;13000rpm離心IOmin,取上清；加入2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min ；13000 rpm離心IOmin,棄上清；用70%乙醇洗漆2次；晾干,加入水溶解,于_20°C保存。I. 2基因克隆以I. I中提取的基因組總DNA為模板，利用如下的引物對進行擴增，引物對的上下游引物序列如下上游引物序列為GCTCTAGAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA；下游引物為GCTCTAGACTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCA；PCR 擴增條件為 95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30 個循環；72°C7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。經北京華大基因研究中心測序分析，擴增產物的核苷酸序列為SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:3第45-146位是內含子，去掉該內含子的cDNA序列為SEQ ID NO:2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO: I。實施例2黑曲霉工程菌的構建2. I表達載體構建對I. 2中得到的PCR產物先進行Xba I單酶切。同樣，對黑曲霉表達質粒pGAMD也進行Xba I單酶切。利用PCR純化試劑盒回收酶切產物。用T4連接酶把酶切產物即克隆基因和表達載體22°C連接過夜。最后，把連接產物導入大腸桿菌DH5 a ;然后通過PCR驗證連接正確與否，最后將相應的陽性克隆表達質粒命名為pVL-pPhy，質粒圖譜見圖I。2.2原生質體制備接種黑曲霉菌絲于PDA平板上生長4天；切取直徑約3cm的菌落置于約IOOmLCMA (2%麥芽提取物、2%葡萄糖，0. 1%細菌蛋白胨)的液體培養基中，30°C，200 rpm振蕩培養過夜；多層紗布過濾收集菌絲；將菌絲置于盛有20 mL裂解酶液(Sigma L1412)酶解2_3小時；取出酶解液，加入0. 8M MgSO4溶液，輕輕搖晃，倒于三層滅菌擦鏡紙過濾，收集濾液，3000 rpm,離心10 min;棄上清，加10 mL I. 2M山梨醇懸浮，然后3000 rpm,離心10 min ；加適量山梨醇懸浮分裝(200 ML/管，IO8個/mL)。2. 3轉化與驗證取10吒Phy-pGAMD DNA加入到200ML原生質體中，接著加入50ML 25%PEG輕輕混勻，室溫靜置20 min ;然后加2mL 25%PEG，輕輕混勻，室溫靜置5min，把原生質體加到50 mL左右熔化后冷卻至45-55°C的上層半固體培養基(0. 059%乙酰胺，0. 152%KH2P04，0. 34%CsCl，0. 052%KC1,1%葡萄糖，21. 85%山梨醇，0. 35%瓊脂糖)，輕輕混勻后倒入下層基礎培養基平板(0. 059% 乙酰胺，0. 152%KH2P04,0. 34%CsC1,0. 052%KC1,1% 葡萄糖，1% 瓊脂粉)，30°C黑暗培養數天至轉化子長出。按照實施例I中的方法提取轉化子基因組DNA為模板，利用引物擴增目的驗證轉化子。利用實施例I中引物進行PCR擴增目的基因。PCR擴增條件為95°C 4min ；94°C 30S ；55°C 40S，72°C Imin 30個循環；72°C 7min。利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析，驗證陽性轉化子。所獲得工程菌命名為黑曲霉LH-KAspergillus niger LH-I)，于2012年12月5日，保藏于“中國典型培養物保藏中心”，保藏號為CCTCC NO: M 2012502。實施例3發酵與酶活測定3. I搖瓶表達將黑曲霉工程菌(CCTCC NO: M 2012502)接種于50mL黑曲霉發酵培養基(1.2%NaN03，0. 05% KCl, 0. 15% KH2PO4,0. 205% MgSO4 7H20，0. 35% NaH2PO4 H20，7% 檸檬酸鈉，4. 5%胰蛋白大豆肉湯，微量元素lmL，4. 1%葡萄糖)，30 0C培養4_5天，離心取上清，進行SDS-PAGE檢測分析，結果如圖2所示，箭頭所指處即為重組表達的植酸酶，重組蛋白本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種植酸酶，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。
【技術特征摘要】
1.一種植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0:lo2.用于編碼權利要求I所述的植酸酶的核苷酸，其序列為SEQID N0:2。3.用于表達權利要求I所述植酸酶的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃亦鈞，許麗紅，張慧丹，張青，徐娟，
申請(專利權)人：青島蔚藍生物集團有限公司，
類型：發明
國別省市：
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