本發(fā)明專利技術涉及一種耐高溫蛋白酶及其菌株選育方法和在酶解中的應用方法。該耐高溫蛋白酶在20～80℃的條件下具有活性和較高的熱穩(wěn)定性；所述耐高溫蛋白酶是由畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)出。用于發(fā)酵產(chǎn)出耐高溫蛋白酶的畢赤酵，分類命名為巴斯德畢赤酵母MMpk-GS115。菌株選育方法包括：準備白色側齒霉菌、畢赤酵母表達載體構建等步驟。耐高溫蛋白酶在酶解中的應用方法是先將耐高溫蛋白酶制備成耐高溫蛋白酶粗酶，然后將酶解基料以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解。本發(fā)明專利技術的優(yōu)點是：該耐高溫蛋白酶菌株能夠產(chǎn)胞外蛋白酶，具有產(chǎn)酶活性高、發(fā)酵時間短，蛋白酶切割位點具有廣泛特異性；在大米粕、豆粕、白酒糟、構樹葉等植物蛋白及酵母培養(yǎng)物的酶解后，小肽含量達到10～50%，能改善植物蛋白，或酵母培養(yǎng)物品質，提高營養(yǎng)價值，更易于動物消化吸收。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及，具體是一種畢赤酵母所產(chǎn)的耐高溫蛋白酶及其菌株選育方法和在植物蛋白及酵母培養(yǎng)物酶解中的應用方法，特別適用于飼料及保健食品行業(yè)，屬于發(fā)酵工程
。
技術介紹
工業(yè)用酶制劑中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工業(yè)用酶中占據(jù)比例最大的酶類，大約占全世界每年總銷售量的60%左右。蛋白酶在飼料、洗滌劑、食品、醫(yī)藥和皮革制造等行業(yè)中有著廣泛的用途。蛋白酶菌株的選育方法有物理、化學因子單獨或復合誘變、原生質體技術、基因工程技術等。現(xiàn)有技術存在的缺點是:利用基因工程技術構建產(chǎn)蛋白酶工程菌的過程中容易發(fā)生基因突變，而且基因工程菌可能無法正確翻譯外源蛋白酶基因等。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的一個目的是:提供一種耐高溫蛋白酶，該高溫蛋白酶是由畢赤酵母所產(chǎn)生，能聞效酶解大米柏、?柏、白酒糟、構樹葉等植物蛋白及酵母培養(yǎng)物，改善其品質，提聞營養(yǎng)價值，改善溶解性、起泡性等功能特性，從而提高了動物對植物蛋白及酵母培養(yǎng)物飼料的利用效率。該耐高溫蛋白酶切割位點廣泛，應用范圍甚廣，可應用于大多數(shù)植物蛋白。本專利技術的另一個目的是:提供耐高溫蛋白酶菌株的選育方法，該方法能夠利用甲醇作為唯一碳源高效表 達耐高溫蛋白酶并分泌到胞外，且分泌很少的自身蛋白，還可以對外源蛋白進行翻譯后修飾。本專利技術的還有一個目的是:提供耐高溫蛋白酶在植物蛋白及酵母培養(yǎng)物酶解中的應用方法，具體是對大米柏、豆柏、白酒糟、構樹葉等植物蛋白及酵母培養(yǎng)物進行酶解的方法，獲得含有大量小肽或氨基酸的產(chǎn)品，改善植物蛋白品質，提高營養(yǎng)價值及動物吸收利用率。培養(yǎng)物水解效率高，反應條件溫和，產(chǎn)生毒性物質的可能性小，同時隨著酶反應的進行，蛋白質的相對分子質量逐漸變小，并轉化為肽或者氨基酸，更易于消化吸收。本專利技術一種耐高溫蛋白酶的技術方案是:該耐高溫蛋白酶在20~80°C的條件下具有活性和較高的熱穩(wěn)定性，在65°C條件下，活性可保持3 h不變，在40~50°C的條件下，24 h仍有60%以上的活性；在pH 6~11范圍內(nèi)均有活性，當pH7~9時24h內(nèi)酶活性保存率為100% ;所述耐高溫蛋白酶菌株由畢赤酵母通過基因工程手段改造而成。—種用于發(fā)酵產(chǎn)出本專利技術所述耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，其分類命名為巴斯德畢赤酵母 MMpk_GS115 iPichia pas tor is MMpk~GS115 )，保藏中心保藏編號為:CCTCC NO: M2014171，保藏日期為:2014年4月28日，保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學；所述巴斯德畢赤酵母遍形態(tài)及生理生化特征包括:呈乳白色，菌體鏡檢呈橢圓形或園形，為甲醇營養(yǎng)型菌。所述一種用于發(fā)酵產(chǎn)出耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，通過甲醇補料發(fā)酵后，發(fā)酵液蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg，小于等于 5000U/mg。一種耐高溫蛋白酶菌株選育方法，包括下述步驟: A、準備白色側齒霉菌用作耐高溫蛋白酶基因序列來源； B、利用重疊延伸PCR技術獲得目的基因序列沙左，即采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來； C、將目的基因插入表達載體:插入構建的常規(guī)的畢赤酵母表達載體p9kNTS、p9kMFII: D、將上述表達載體的重組和線性化； E、電轉化巴斯德畢赤酵母MMpk-GSl15:經(jīng)重組和線性化后，電轉化； F、初篩、復篩，最后獲得一株耐聞溫蛋白酶菌株。所述的D步驟初篩、復篩是:搖瓶酶活測定篩選，以篩選到的酶活相對很高的酵母工程p9kNTS-Fpk-GS115作為宿主菌，將重組質粒p9kNTS_Fpk、p9kMF I1-Fpk線性化后進行二次電轉化，再進行較高濃度的G418梯度高拷貝篩選，酶活測定篩選，獲得一株耐高溫蛋白酶的菌株。本專利技術一種耐高溫蛋白酶在酶解中的應用方法，先將耐高溫蛋白酶制備成耐高溫蛋白酶粗酶，然后將酶解基料以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解，該酶解的步驟包括: 首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，干酶解基料與水的比為1:1~9，調整PH6~9，然后在溫度為55~65°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為300~5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3~36 h，最后得到液態(tài)的酶解的蛋白質，或經(jīng)干燥得到干的酶解的蛋白質； 所述的酶解基料為發(fā)酵植物蛋白，或酵母培養(yǎng)物；所述發(fā)酵植物蛋白包括大米柏、豆柏、白酒糟、構樹葉。一種本專利技術所述的耐高溫蛋白酶在酶解大米柏中的應用方法，其酶解基料為大米柏，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1: 9，調整pH8，在60°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3h。一種本專利技術所述的耐高溫蛋白酶在酶解豆柏中的應用方法，其酶解基料為豆柏，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:9，調整PH9，然后在溫度為65°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為16h。一種本專利技術所述的耐高溫蛋白酶在酶解白酒糟中的應用方法，其酶解基料為白酒糟，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:5，調整pH8，然后在溫度為55°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為12h。一種本專利技術所述的耐高溫蛋白酶在酶解構樹葉中的應用方法，其酶解基料為構樹葉，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:9，調整pH為自然狀態(tài)，然后在溫度為60°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3h。一種本專利技術所述的耐高溫蛋白酶在酶解酵母培養(yǎng)物中的應用方法，其酶解基料為酵母培養(yǎng)物，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:7，調整pH8，然后在溫度為55°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為36h。本專利技術具有以下優(yōu)點: I)本專利技術構建的菌株發(fā)酵產(chǎn)生耐高溫蛋白酶的粗酶活力可高達50000 U/ml。2)所產(chǎn)耐高溫蛋白酶切割位點廣泛、耐熱性和耐堿性，在20~80°C，pH 6~11范圍內(nèi)均有活性，在親水性有機溶劑如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮和乙醇中仍有較高的活性。耐高溫蛋白酶粗酶液保存時間長久。3)本專利技術篩選到的耐高溫蛋白酶可以分泌到培養(yǎng)基中，方便純化，便于工業(yè)應用。4)本專利技術的耐高溫蛋白酶應用廣泛，可降解多種植物蛋白，如豆柏、米柏、植物蛋白酵母培養(yǎng)物、構樹葉、酒糟等。5)本專利技術的耐高溫蛋白酶可以使植物蛋白及酵母培養(yǎng)物中蛋白質降解率達到60%以上，產(chǎn)物小肽含量達10~50%。用該酶處理植物蛋白和酵母培養(yǎng)物可以改善蛋白品質，提高營養(yǎng)價值，改善溶解性、起泡性等功能特性，更易于動物體消化吸收。【具體實施方式】 : 結合實施例對本專利技術作進一步說明如下: 實施例1:是本本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種耐高溫蛋白酶，其特征在于，該耐高溫蛋白酶在20～80℃的條件下具有活性和較高的熱穩(wěn)定性，在65℃條件下，活性可保持3?h不變，在40～50℃的條件下，24?h仍有60%以上的活性；在pH?6～11范圍內(nèi)均有活性，當pH7～9?時24h內(nèi)酶活性保存率為100%；所述耐高溫蛋白酶產(chǎn)生菌株是由畢赤酵母通過基因工程手段改造而成。
【技術特征摘要】
1.一種耐高溫蛋白酶，其特征在于，該耐高溫蛋白酶在20~80°C的條件下具有活性和較高的熱穩(wěn)定性，在65°C條件下，活性可保持3 h不變，在40~50°C的條件下，24 h仍有60%以上的活性；在pH 6~11范圍內(nèi)均有活性，當pH7~9時24h內(nèi)酶活性保存率為100%;所述耐高溫蛋白酶產(chǎn)生菌株是由畢赤酵母通過基因工程手段改造而成。2.一種用于發(fā)酵產(chǎn)出權利要求1所述耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，其特征在于，分類命名為巴斯德畢赤酵母MMpk-GSl 15 {Pi chi a pastor is MMpk-GSl 15 )，保藏中心保藏編號為:CCTCC NO: M 2014171，保藏日期為:2014年4月28日，保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學；所述巴斯德畢赤酵母遍形態(tài)及生理生化特征包括:呈乳白色，菌體鏡檢呈橢圓形或園形，為甲醇營養(yǎng)型菌。3.根據(jù)權利要求2所述的一種用于發(fā)酵產(chǎn)出耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，其特征在于，通過甲醇補料發(fā)酵后，發(fā)酵液蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg,小于等于5000U/mg。4.一種權利要求1所述的耐高溫蛋白酶菌株選育方法，其特征在于，包括下述步驟: A、準備白色側齒霉菌用作耐高溫蛋白酶基因序列來源； B、利用重疊延伸PCR技術獲得目的基因序列沙左，即采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來； C、將目的基因插入表達載體:插入構建的常規(guī)的畢赤酵母表達載體p9kNTS、p9kMFII: D、將上述表達載體的重組和線性化； E、電轉化巴斯德畢赤酵母MMpk-GSl15:經(jīng)重組和線性化后，電轉化； F、初篩、復篩，最后獲得一株耐聞溫蛋白酶菌株。5.根據(jù)權利要求4所述的耐高溫蛋白酶菌株選育方法，其特征在于，所述的D步驟初篩、復篩是:搖瓶酶活測定篩選，以篩選到的酶活相對很高的酵母工程p9kNTS-Fpk-GS115作為宿主菌，將重組質粒p9kNTS-Fpk、p9kMF I1-Fpk線性化后進行二次電轉化，再進行較高濃度的G418梯度高拷貝篩選，酶活測定篩選，獲得一株耐高溫蛋白酶的菌株。6.一種權利要求4或5所述的耐高溫蛋白酶在酶解中的應用方法，其特征在于，先將耐高溫蛋白酶制備成耐高溫蛋白酶...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：葛向陽，彭楠，方玉美，趙述淼，李俊，遲晨，潘超，姜超，梁運祥，
申請(專利權)人：華中農(nóng)業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：湖北;42
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。