一種綠僵菌發酵生產酯酶的培養基及方法技術

本發明專利技術涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本發明專利技術涉及一種綠僵菌發酵生產酯酶的培養基及方法。所述培養基的原料含有酵母粉1-3w%，D-山梨醇1-4w%，Ba2+0.01-0.04mol/L，VB40.005-0.02w%，三醋酸甘油酯2w%，培養基初始pH=6.6-7.5。該方法通過將發酵種子液按接種于培養基，250mL的三角瓶裝液量為125mL，接種量10%，于27℃，轉速160r/min下培養。本發明專利技術的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于綠僵菌發酵生產酯酶的培養基，具有酯酶產率高，酯酶活力高等優點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及真菌的發酵培養基及工藝。更具體地，本專利技術涉及。
技術介紹
酯酶(Esterase, EC3. I. I. I)是一類能夠催化酯鍵水解形成相應的酸和乙醇的酶類，廣泛分布于動植物和微生物(Bronscheuer，2002)。微生物能夠產生多種具有酯解活力的酶類，包括酯酶(Esterase)和脂肪酶(Lipase)。酯酶能夠水解或者合成酰基碳鏈長度小于10的甘油酯類，對于酰基碳鏈長度大于10的甘油酯類則沒有催化活性。酯酶催化反應具較廣的底物范圍，在催化底物反應時不需要輔助因子，在一些變形劑，如有機溶劑中有很高的穩定性，此外酯酶催化反應具有立體特異性和區域專一性的 特點。由于酯酶以上優點，使得酯酶在很多領域有著廣泛的應用。近年來，全球市場工業用酶市場不斷擴大，而酯酶是其中一種被廣泛使用的生物催化劑，在全球工業用酶市場占據很高的很高比例。隨著日益高漲的能源成本、石油煤炭等不可再生資源的衰竭、環境污染以及經濟全球化，大規模的可再生的，環保的生物處理工藝來代替或者互補傳統不可再生，高能耗，高污染的工業生產工藝是刻不容緩。在食品加工方面，利用酯酶分解底物后產物為呈香化合物，將酯酶己應用于奶制品的增香、改善稻米和發酵類飲料的香味等方面，如用酯酶處理過的奶制品比未處理的具有更好的香味和可接受性；在農業生產方面，人工合成的有機磷化物廣泛用于殺蟲劑，這些物質的殘留將危害環境并且最終危害人類健康，來自號Brevundimonas diminuta和Alteromonas sp.酯酶被證明能有效降解這類物質,廣泛應用于清除有機磷殺蟲劑的污染；在醫藥合成方面，酯酶主要用于拆分手性藥物。來自于sp.的酯酶被應用于抗炎藥物布洛芬的生產，來U子Bacillus cogulans的酯酶廣泛應用于生物活性物質DL-甘油醇縮丙酮的生產；在輕化工業方面，酯酶廣泛應用于制漿造紙、紡織品、皮革處理等。來自于Ophiostorm piceae的酯酶能夠有效的水解甘油三酯和幽醇酯，酯酶能夠顯著降低制漿造紙過程中的樹脂，因而能夠顯著提高機器的運行效率并改善紙張的品質，因而廣泛應用于制漿造紙工業；化工日用品方面，堿性酯酶具有明顯的助洗作用，加入后使得洗滌劑朝低磷或無磷的方向反應，有利于降低水體中無機磷含量，從而減少環境水體富營養化。酯酶除了在上述的食品加工、農業生產、醫藥合成以及輕化工業等行業廣泛使用外，酯酶還被認為在環保型燃料、生物柴油等生物能源的開發具有廣泛的前景。微生物酯酶是一類重要的工業酶類，國內外上從20世紀90年代到現在，相繼開發出各種酯酶，但是依舊無法滿足現代工業需求。我國真菌產酯酶的相關研究起步較晚，在期刊雜志上鮮有報道，覃擁靈等人利用誘變裂褶菌ZM37. 8，獲得穩定的正突變高產菌株E1，其產酯酶量為87. 56U/mL(覃擁靈等，2007)。真菌發酵有別于細菌發酵，真菌在發酵過程中可以隨時取樣接種于LB培養基，檢測是否染雜菌；也可通過添加抗生素減少染菌，且真菌發酵條件溫和，易于控制等鮮明特點。因此真菌發酵法生產的獨特優勢，有利于真菌酯酶更廣泛地工業化應用。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供。本專利技術首先提供了一種綠僵菌發酵生產酯酶的培養基，所述培養基的原料含有酵母粉 l-3w%, D-山梨醇 1-4 w %, Ba2+ O. 01-0. 04 mol/L, VB4O. 005-0. 02 w %，三醋酸甘油酯2w%,培養基初始pH=6. 6-7. 5。 更優選地，所述培養基的原料按重量分數計，含有酵母粉2%，D-山梨醇3%，BaCl2 · 2H20 O. 24%，VB4O. 01%，三醋酸甘油酯 2%，培養基初始 pH=6. 9。其次，本專利技術還提供了一種綠僵菌發酵產酯酶的方法，所述方法包含以下步驟 (a)將綠僵菌接種種子培養基，制得發酵種子液； (b)將步驟(a)中制得的發酵種子液按接種于權利要求I或2所述的培養基，250mL的三角瓶裝液量為125mL，接種量10%，于27°C，轉速160 r/min下培養。所述種子培養基的原料含有按培養基重量計，牛肉膏2.0%，蔗糖2.0%，蛋白胨O. 2%，酵母粉 O. 2%, (NH4)2SO4 O. 5%, K2HPO4 O. 1%，MgSO4 7H20 O. 05%, ρΗ5· 5。 本專利技術采用的綠僵菌為綠僵菌M a Y D T R 03 (以下簡稱綠僵菌Ma_3)(何學友等，應用綠僵菌和白僵菌林間防治木麻黃毒蛾的初步研究，福建林業科技，2011年6月)。采用本專利技術優化后的培養基，菌齡4d，發酵周期54h，發酵產生結果綠僵菌Ma-3產酯酶為45U/mL以上。本專利技術的發酵方法有發酵周期短；條件溫和，易于控制；提供的用于綠僵菌發酵生產酯酶的培養基，具有酯酶產率高，酯酶活力高等優點。附圖說明圖I為對硝基苯酚標準曲線。具體實施例方式本專利技術用下列實施例來進一步說明本專利技術，但本專利技術的保護范圍并不限于下列實施例。實施例I 單因素實驗確定培養基最優成分(I)種子培養基配制牛肉膏20. 0g，蔗糖20. 0g，蛋白胨2. 0g, (NH4)2SO4 5. 0g，酵母粉2.Og7K2HPO4 I. Og ,MgSO4 ·7Η20 O. 5g，蒸餾水定容到 IOOOmL, il pH 至 5. 5，分裝于 250mL 的三角瓶，每個三角瓶含150mL。O. IMPa，滅菌20min。使用前可加入抗生素對培養基預處理。(2)發酵種子的制作將綠僵菌Ma-3接種于馬鈴薯瓊脂培養基上，于27°C下培養5d，待其產孢子，即活化；將活化后的菌株用接種針將孢子粉接種至種子培養基，27°C，轉速160 r/min下培養24h，即為發酵液。(3)酶液的制備取步驟(2)下的發酵液在4°C下，5000 r/min離心，15min，得上清液即為粗酶液待用。按酶活性測定在在波長405nm處測定吸光值。換算成酶活單位U/mL0(4)酯酶酶活測定根據Westlake K等人的酯酶酶活測定方法，進行改進，取I mLlmmol/L的對硝基苯酯酸酯(p_NPC2)溶液、2 mL 50mM Tris-HCl (pH 7.2)緩沖液加人試管中,放人恒溫水浴器中，40°C保溫15 min，再加I mL酶液振蕩反應4. 5 min，立即加入2 mL95%乙醇終止反應，在波長405nm處測定吸光值。另以在沸水浴中失活的酶液代替原酶液為空白。酶活力單位的定義為在本實驗測定條件下，以每分鐘催化產生I μ mol的對硝基苯酚所需的酶量為I個酶活力單位(U)。酶活力(U/g或U/mL)=AXKXVXn/(tXm) (A為樣品的吸光度；K為吸光常數；V為反應試劑的總體積；n為酶液的稀釋倍數；t為反應時間；m為酶液質量或體積，g或mL)。(5)標準曲線的制作精確配制對硝基苯酚2mmol/L標準溶液；首先在試管中加入不同體積50mmol/L Tris-Hcl pH7. 2，在40°C保溫15 min，在加入不同體積的對硝基苯酚標準液。反應4. 5min后立即加入2mL95%乙醇。反應體系為6mL (對硝基苯酚和緩沖液4mL，終止液為2mL)。每個濃度做3平行實驗，為空白對照。在波長405 nm處測定吸光值。 以吸光值為縱坐標，標準溶液溶度為橫坐本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種綠僵菌發酵生產酯酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料含有酵母粉1？3w%，D？山梨醇1？4？w？%，Ba2+？0.01？0.04？mol/L，VB40.005？0.02？w？%，三醋酸甘油酯2w%，培養基初始pH=6.6？7.5。

【技術特征摘要】
1.一種綠僵菌發酵生產酯酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料含有酵母粉l-3w%, D-山梨醇 1-4 w %, Ba2+ O. 01-0. 04 mol/L，VB4O. 005-0. 02 w %，三醋酸甘油酯 2w%，培養基初始pH=6. 6-7. 5。2.—種綠僵菌發酵生產酯酶的培養基，其特征在于，所述培養基的原料按重量分數計，含有酵母粉2%，D-山梨醇3%，BaCl2 · 2H20 O. 24%，VB4O. 01%，三醋酸甘油酯2%，培養基初始ρΗ=6· 9。3.—種綠僵菌發酵產酯酶的方法，其特征在于...

【專利技術屬性】
技術研發人員：邱君志，蘇禮超，涂潔，宋飛飛，關雄，邱云鋒，李小霞，郭慶豐，何肖云，吳國輝，
申請(專利權)人：福建農林大學，
類型：發明
國別省市：