一種微擬球藻突變株及其重離子誘變選育方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及微生物工程領(lǐng)域，具體的說是一種微擬球藻突變株及其重離子誘變選育方法。微擬球藻突變株分類學(xué)命名：Nannochloropsis?sp.OZ-1HP-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2012年5月14日，保藏號為：CGMCC?No.6140。本發(fā)明專利技術(shù)突變藻株生物量積累在培養(yǎng)末期較野生株提高19％，葉綠素a含量在培養(yǎng)第四天較野生株提高45％，類胡羅卜素含量較野生株提高47％。該突變株油脂積累末期生物量較野生株提高33％，油脂產(chǎn)率提高28％，突變株脂肪酸組成與野生型藻株相比未發(fā)生顯著性變化，突變株油脂成分分析顯示TAG含量比野生型提高14％。該突變株生長速度快、油脂產(chǎn)率高、TAG含量高，可以為微擬球藻生物燃料產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)藻種。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及微生物工程領(lǐng)域，具體的說是。
技術(shù)介紹
能源是人類社會賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，高效、清潔的能源利用是實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重要保證。隨著常規(guī)不可再生化石資源的不斷減少、日益顯著的全球氣候變暖，使得能源、資源與環(huán)境成為人類社會可持續(xù)發(fā)展所面臨的重要問題。生物質(zhì)能源，包括生物柴油、生物乙醇等，由于其具有可再生性和環(huán)境友好等特點(diǎn)，被認(rèn)為是解決能源危機(jī)的最有潛力的途徑之一。微藻由于具有生物質(zhì)積累速度快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、含油量高、具有綜合利用價值等特性，被認(rèn)為是最有潛力的生物質(zhì)能源原料。以微藻生產(chǎn)生物柴油為例，專家做了一個保守的估計，與每公頃高產(chǎn)油植物(如油棕櫚、麻瘋樹)每年可以產(chǎn)生1800-6000升油脂相比，每公頃微藻每年可以產(chǎn)生5萬-13萬升油脂。微藻用于生產(chǎn)生物燃料的優(yōu)勢明顯，但目前進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還面臨著巨大挑戰(zhàn)，微藻生物燃料生產(chǎn)成本依然較高。降低微藻生物燃料生產(chǎn)成本主要集中在兩個方面一是降低生產(chǎn)工藝成本；二是降低生產(chǎn)原料成本。而微藻生物燃料生產(chǎn)成本中的75%是原料成本。從降低生物原料成本入手成為降低微藻生物燃料生產(chǎn)成本的重中之重。提高微藻的油脂產(chǎn)率，培育生物量積累速率快、油脂產(chǎn)率高的藻種，提供優(yōu)質(zhì)生物燃料原料，是降低微藻生物燃料生產(chǎn)成本的有效手段。微擬球藻(Nannochloropsis sp. 0Z-1)是直徑為2-3 μ m的真核單細(xì)胞綠色微藻， 歸屬于褐藻門，大眼藻綱，單珠藻科，其細(xì)胞內(nèi)油脂含量可達(dá)干重的68%，是公認(rèn)的最有希望用于工業(yè)化的高產(chǎn)油海水藻之一。近年來已有多例以微擬球藻為材料在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行生物柴油制備的報道，該藻的產(chǎn)業(yè)化前景非常廣闊。近年來，重離子束特別是低能碳離子束作為一種新興的輻射源，由于其對微生物與植物種子有很強(qiáng)的致突變作用，已經(jīng)在微生物及植物誘變育種研究中取得了巨大的經(jīng)濟(jì)與社會效益，為育種提供了新的途徑。與傳統(tǒng)的誘變源相比，重離子束具有以下重要特點(diǎn)(I)傳能線密度大，能在生物介質(zhì)中產(chǎn)生高密度的電離、激發(fā)、能量和質(zhì)量沉積，造成生物介質(zhì)的損傷，易于突變體的形成；(2)能量沉積過程中，在其射程末端存在一個尖銳的能量損失峰，使得生物樣品的局部受損，這種局部受損的位置可隨離子能量的高低而變化，是選擇可控的，有利于宏觀定點(diǎn)、定位誘變，實(shí)現(xiàn)定向育種；(3)損傷后修復(fù)效應(yīng)小，可產(chǎn)生大量的突變且突變體穩(wěn)定；(4)相對生物學(xué)效應(yīng)高，因此突變體的產(chǎn)生效率高且突變譜廣。而目前為止，這種高效的誘變方式尚未應(yīng)用于產(chǎn)油微藻的育種。微擬球藻油脂含量高，是非常有潛力的生物柴油制備原料，但微藻大規(guī)模養(yǎng)殖成本高，生物量累積比較緩慢。采用生物技術(shù)手段誘變藻株，針對生長速率篩選微擬球藻突變株具有重要價值。而目前用于藻類育種的誘變技術(shù)篩選時間較短，通常只經(jīng)過一次篩選， 得到的突變株遺傳穩(wěn)定性較差，容易出現(xiàn)回復(fù)突變。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的在于提供。為實(shí)現(xiàn)上述目的本專利技術(shù)采用技術(shù)方案為一種微擬球藻突變株，其特征在于微擬球藻分類學(xué)命名Nannochloropsis sp. OZ-I ΗΡ-l,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號；保藏日期:2012年5月14日，保藏號為=CGMCC No. 6140。所述微擬球藻的誘變選育方法，其特征在于以野生型微擬球藻 (Nannochloropsis sp. OZ-I)作為出發(fā)藻株經(jīng)光照培養(yǎng)至對數(shù)生長期，利用重離子加速器對處于對數(shù)生長期的藻株進(jìn)行誘變，獲得微擬球藻突變株Nannochloropsis sp. 0Z-1HP-1。所述微擬球藻的誘變選育方法，其特征在于利用重離子加速器對生長至對數(shù)生長期的球藻進(jìn)行不同劑量的碳重離子的輻射，將致死率達(dá)到50%的輻射劑量的藻株分別進(jìn)行活化，再逐級傳代培養(yǎng)，選取在逐級傳代培養(yǎng)中Fv/Fm和0D750值穩(wěn)定提高的生長迅速突變藻株，而后轉(zhuǎn)接于鼓泡柱式光反應(yīng)器中傳代培養(yǎng)進(jìn)一步篩選，獲得微擬球藻突變株 Nannochloropsis sp. 0Z-1HP-1。所述的微擬球藻的應(yīng)用，其特征在于所述微擬球藻Nannochloropsis sp. 0Z-1 HP-I用于油脂、生物柴油、脂肪酸、葉綠素a、類胡蘿卜素和或生物質(zhì)成分。本專利技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)本專利技術(shù)通過重離子誘變微擬球藻，采用葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)Imaging PAM和酶標(biāo)儀，以Fv/Fm和OD75tl作為考察指標(biāo)，對突變體庫進(jìn)行高通量篩選，具有快速便捷的特點(diǎn)，保證了一定數(shù)量的篩選量。而通過多步逐級篩選的方法，進(jìn)一步保證了微藻優(yōu)良性狀的穩(wěn)定性，最終獲得的優(yōu)良藻株在不同規(guī)模的培養(yǎng)體積中都具有較高的生長速率。本專利技術(shù)對單細(xì)胞產(chǎn)油微藻Nannochloropsis sp. 0Z-1進(jìn)行重離子誘變,獲得一株生長速率更快的突變株HP-I。該突變藻株生物量積累在培養(yǎng)末期較野生株提高19%，葉綠素a含量在培養(yǎng)第四天較野生株提高45%，類胡羅卜素含量較野生株提高47 %。該突變株油脂積累末期生物量較野生株提高33 %，含油量與野生株相比未顯著性提高，油脂產(chǎn)率提高28%，由O. Zlgr1CT1提高為O. 27gr1d-10油脂特性分析顯示突變株脂肪酸組成與野生型藻株相比未發(fā)生顯著性差異，突變株油脂成分中TAG含量較野生型藻株提高14%。附圖說明圖I為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的微擬球藻重離子誘變不同輻照劑量致死率效果圖。圖2為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I生長曲線圖。圖3A為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I葉綠素a含量對比圖。圖3B為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I類胡蘿卜含量對比圖。圖4A為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I產(chǎn)油期生長曲線圖。圖4B為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I光系統(tǒng)II最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)圖。圖5A為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I油脂含量圖。圖5B為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的微擬球藻野生型藻株WT和突變株HP-I油脂產(chǎn)率圖。圖6為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的氣相色譜分析野生株WT油脂脂肪酸組成圖。圖7為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的氣相色譜分析突變株HP-I油脂脂肪酸組成圖。圖8為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的薄層層析分析野生株WT油脂組成圖。圖9為本專利技術(shù)實(shí)施例提供的薄層層析分析突變株HP-I油脂組成圖。具體實(shí)施方式根據(jù)下列實(shí)施例及附圖，可以更好的理解本專利技術(shù)。實(shí)施例I:微擬球藻重離子誘變突變體庫的創(chuàng)制及高生長速率突變株篩選I)取微擬球藻野生藻株(Nannochloropsis sp. 0Z-1)作為出發(fā)藻株；將所述藻株從平板上接種至含IOOmL Blue-Green Medium (簡稱BGl I)培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中25°C，100ymol/m2 · s，連續(xù)光照培養(yǎng)至對數(shù)生長期。BGll培養(yǎng)液的組成和配制參見表1，在配置培養(yǎng)液時，將以下成分以固體形式加入蒸餾水中配成100-1000倍的母液，使用時再按需稀釋配置成培養(yǎng)液。而后將BGll培養(yǎng)基分裝封口，滅菌處理。取出滅過菌的培養(yǎng)基，冷卻至室溫后，待用。表I BGll培養(yǎng)基的組成及其含量成分儲液濃度使用時終濃度NaNO3150g/LI. 5g/本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種微擬球藻突變株，其特征在于：微擬球藻突變株分類學(xué)命名：Nannochloropsis?sp.OZ?1?HP?1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2012年5月14日，保藏號為：CGMCC?No.6140。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種微擬球藻突變株，其特征在于微擬球藻突變株分類學(xué)命名Nannochloropsissp. OZ-I HP-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2012年5月14日，保藏號為=CGMCC No. 6140。2.按權(quán)利要求I所述微擬球藻突變株的誘變選育方法，其特征在于以野生型微擬球藻(Nannochloropsis sp. OZ-I)作為出發(fā)藻株經(jīng)光照培養(yǎng)至對數(shù)生長期,再利用重離子加速器對處于對數(shù)生長期的藻株進(jìn)行誘變，獲得微擬球藻Nannochloropsis sp. OZ-I HP-I突變株。3.按權(quán)利要求I...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馬玉彬，張東遠(yuǎn)，周功克，王芝瑤，周翠燕，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，波音中國投資有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：