一種高效獲得葡萄藻單細胞的方法及其應用技術

本發明專利技術公開了一種高效獲得葡萄藻單細胞的方法及其應用，所述方法包括去除濕藻表面部分水分，使濕藻體含水量為60-80wt%。所述方法簡單易行、低成本、高效的獲得高活性的葡萄藻單細胞，而同時獲得的胞外組織能比較容易的進行油脂提取。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物領域，尤其涉及高效獲得葡萄藻單細胞的方法及其應用。
技術介紹
隨著全球化石能源的短缺及由于使用化石能源帶來的環境問題，尋找新型可替代能源勢在必行。微藻具有生物量大、生長周期短及含油脂類物質高等特點，在CO2減排和生物燃料開發上都有廣闊的開發前景。可利用微藻開發的生物燃料主要兩種類型，一類是利用微藻合成的脂肪酸通過酯化生產生物柴油，因大多數微藻通過脂肪酸合成途徑可積累大量油脂，故目前多采用此類研發思路來開發微藻生物柴油技術；另一類是利用微藻合成的烷烴類物質生產生物航空煤油，在微藻中，葡萄藻合成的烴類物質與石油性質非常相似，可代替石油用于航空煤油的生 產。航空煤油原本是石油產品之一，是由直餾餾分、加氫裂化和加氫精制等組分及必要的添加劑調和而成的一種透明液體。主要由不同餾分的烴類化合物組成。近些年來，我國航空燃料的需求不斷增長。目前，國內航煤消費量保持每年13%左右的增長速度，遠高于國際5%的增長水平，2010年國內航煤消費已達到1800萬噸以上。現在我國已成為年消費量近2000萬噸的航空燃料消費大國，按照有關國際組織預測，2020年生物航煤將達到航油總量的30%。目前國外已有商業化的生物航空煤油產品，而2012年2月我國的首個生物航空煤油產品的適航審定申請也由中國民用航空局正式受理。但該生物航煤是以多種動植物油脂為原料，采用自主研發的加氫技術、催化劑體系和工藝技術生產的。仍然存在生產原料有限，生產工藝復雜，造價高等問題，而用藻類進行生物航空煤油的生產則可以在很大程度上克服這些問題。如上文所述，藻類中比較適于生物航空煤油生產的是葡萄藻。葡萄藻又名叢粒藻，屬綠藻門、四胞藻綱、葡萄藻科、葡萄藻屬，顯微鏡下，葡萄藻呈串狀集落生長，細胞梨形，寬5-9 μ m，長9-13 μ m,具有明顯細胞壁，細胞壁分內外兩層，內層由粘性多糖構成纖維狀，外層由三層薄層形成鞘；藻體包埋于藻叢中，在外圍形成一層透明或半透明的油膜。在透射電子顯微鏡下可見，圍繞著細胞基部的厚基質結構是由連續的細胞分裂產生的外壁構成，借以將藻體細胞的集落粘合起來。常為2個或4個細胞組成一組，各個膠質漏斗在中央互相聯合，所有的細胞或多或少地呈輻射狀排列。葡萄藻以似親孢子營無性生殖。葡萄藻的產烴量25%-86%，大部分烴顆粒儲存在細胞外壁和折射紹絲中，其分布可能會隨培養階段發生變化。葡萄藻雖產油率高，但其生長緩慢，室外養殖容易污染，故很難得到大規模的推廣應用，優良葡萄藻藻種的選育是克服葡萄藻推廣應用的關鍵環節。而在葡萄藻生長過程中多個細胞聚集成團，在藻種選育上，特別是在基因工程改造上很難操作，這就需要能高效產生高活性葡萄藻單細胞的技術。傳統的從細胞群體中獲得單細胞的方法主要有機械破碎，超聲破碎，酶解等方法，但此類方法多對細胞損傷較大，得到的細胞質量低，生產成本較高，生產效率低，往往不能高效的獲得單細胞，獲得的單細胞往往是單細胞和原生質體混合物，其中破碎組織占據大部分。另外，葡萄藻的結構特性表明，大部分烴顆粒儲存在細胞外壁中，故藻體細胞在油脂提取中成為障礙物，如何去除藻體細胞障礙物成為提高油脂提取率的關鍵技術。因此，本領域中需要可高效的獲得高活性的葡萄藻單細胞以及葡萄藻胞外組織的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提出一種獲得葡萄藻單細胞以及葡萄藻胞外組織的方法，通過所述方法可以高效地獲得高活性的葡萄藻單細胞，同時獲取除去了藻細胞的葡萄藻胞外組織，以提聞油脂提取率。為達此目的，本專利技術采用以下技術方案本專利技術提供一種從細胞群體生長的葡萄藻中高效獲得大量完整且具有高活性的單細胞方法，其特征在于，所述方法包括去除濕藻藻體細胞表面的部分水分。本專利技術的方法可以包括(a)收集濕藻藻體；(b)去除所述藻體細胞表面的部分水分；(C)形成所述藻體的單細胞和胞外組織的混合物；(d)任選地，還包括收集所述單細胞。本專利技術提供的方法還可以包括(a)收集濕藻藻體；(b)去除所述藻體細胞表面的部分水分；(c)形成所述藻體的單細胞和胞外組織的混合物；(e)任選地，收集所述胞外組織；和(f)任選地，從所述胞外組織提取油脂。在本專利技術的方法中，去除所述藻體細胞表面的部分水分的步驟可以在5-40°C，優選10-35°C，最優選20-30°C下進行。在本專利技術的方法中，可用吸水材料去除藻體細胞表面的部分水分，優選地，所述吸水材料是吸水紙或干燥劑。在本專利技術的方法中，可采用通風干燥處或低溫干燥設備去除藻體細胞表面的部分水分。在本專利技術的方法中，可通過200-400目，優選250-350目，更優選300目篩絹過濾來分離所述單細胞和所述胞外組織。在本專利技術的方法中，去除藻細胞表面的水分后，藻體的含水量可以為60wt%-80wt%，優選 65wt%-75wt%，最優選 70wt%。在本專利技術的方法中，去除藻體細胞的表面水分的步驟可在5°C、8°C、10°C、12°C、15°〇、181、201、221、251、281、301、321、351、381或401下進行。在第二個方面，本專利技術提供了如第一方面所述的方法藻類培養、藻種基因工程改造、藻種自然選育、藻種誘變育種、色素生產或藻類油脂提取中的應用。在第三個方面，本專利技術提供了如第一方面所述的方法在生物航空煤油生產中的應用。在本文中，吸水材料是指可以大量吸收水分的材料，一般指吸水率超過50%的材料。本專利技術的有益效果I.簡單易行、低成本、高效的獲得高活性的葡萄藻單細胞。由于本專利技術的方法不需要機械研磨和超聲處理，因而整個過程不使用機械化、電氣化等設備，成本低、能耗低。2.本專利技術完全依靠細胞表面失水而得到單細胞，細胞活性高，有利于后續的再培養，轉基因或選育工作。3.獲得的胞外組織能比較容易的進行油脂提取，因為葡萄藻合成的油脂大部分分 泌到胞外組織中，故剩余的胞外組織可以用于油脂提取。4.葡萄藻細胞聚團生長、內部的細胞接受不到光，光能利用率低、產量低。而通過本專利技術的方法獲得的單細胞進行再培養時，可有效提高光能利用率，使得葡萄藻產量明顯增加。附圖說明圖I是采用本專利技術的方法將葡萄藻單細胞與胞外組織分離的流程示意圖。圖2是采用本專利技術的方法處理后的葡萄藻顯微鏡圖片。圖3是采用本專利技術的方法獲取無菌葡萄藻單細胞的流程示意圖。圖4是采用本專利技術的方法獲取胞外組織并提取油脂的流程示意圖。圖5是使用采用本專利技術的方法處理后的葡萄藻單細胞和未處理的藻體進行培養的生長曲線圖。具體實施例方式下面結合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本專利技術的技術方案。實施例I將葡萄藻單細胞與胞外組織分離本實施例的技術方案如圖I所示，其具體步驟為將培養的藻體收集，分別在5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C或 40°C下，去除所述藻體的表面水分。當所處理的藻體較少時，可采用干凈的吸水紙、干燥劑或其它吸水材料將藻體細胞表面部分水分去除；而當處理大量藻體時，可將收集的藻體放在通風干燥處或使用低溫干燥設備將細胞表面的部分水分去除。將處理后的葡萄藻藻體放入已滅菌的培養基或蒸餾水中，葡萄藻單細胞與胞外組織自然分離，成為單細胞和胞外組織的混合物(見圖2)。其中胞外組織可用較大孔徑的濾膜或網篩過濾收集，留在液體中的為葡萄藻單細胞，或可通過不同轉速離心分離葡萄藻單細胞和胞外組織。測定了十組去除細本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種從細胞群體生長的葡萄藻中分離藻體的單細胞和胞外組織的方法，其特征在于，所述方法包括去除濕藻藻體細胞表面的部分水分。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳傳紅，張凱，吳洪，
申請(專利權)人：新奧科技發展有限公司，
類型：發明
國別省市：