一種基于微流控芯片的糖尿病血管病變模型的建立方法技術

一種基于微流控芯片的糖尿病血管病變模型的建立方法，特別針對糖尿病血管病變過程中，血管內皮炎癥導致的血管壁黏附性變化特征，模擬血流條件下，單核細胞在內皮細胞表面的黏附與滾動、血栓形成及血管阻塞現象。該微流控芯片主要由細胞入口池(1)、細胞培養室(2)和出口池(3)組成，細胞培養室(2)上連細胞入口池(1)，細胞培養室(2)下連出口池(3)?？蓪⒏哐菞l件下血管病變的模擬與血流條件下單核細胞與病變部位內皮細胞表面的相互作用研究集成于一體，能夠同時實現糖尿病并發癥中病灶部位的模擬以及血栓形成的原位模擬。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及將微流控芯片技術應用到組織仿生以及實時監測的細胞生物學研究的
，具體涉及，并應用于單核細胞在病變部位表面的運動特征的研究方法。
技術介紹
醫學研究顯示，有50%的心腦血管疾病是由糖尿病引起的。糖尿病人群中血管疾病患病率的增加主要原因是動脈粥樣硬化的速度加快。與非糖尿病個體相比，糖尿病或糖耐量異常的個體常伴有其他代謝的異常，促進了動脈粥樣硬化；同時，糖尿病增加了促凝血狀態，加速了動脈粥樣硬化的形成。因此，糖尿病患者發生動脈粥樣硬化的年齡更早，進展成臨床腦血管事件更快。糖尿病與血管病變已逐漸成為當今醫學和生物學界研究的熱點，目前還主要集中于細胞水平的研究。細胞并不是一個孤立的生命體，細胞與細胞之間的相互作用也不是簡單的機械連接，而是存在各種形式的相互交流的。探索細胞間相互作用及相應的信號通路，對疾病治療等有著重要作用。糖尿病與血管病變的研究發展至今，主要的研究手段仍舊依賴于孔板，集中觀察單一或者多種因素刺激下細胞的形態變化、生長過程、遷移和增殖行為等。而在眾多的細胞行為研究中，細胞運動作為生物體發育和形態建成等重要生命過程的基礎，備受關注。細胞運動一般起始于細胞對其微環境刺激的反應，微環境刺激細胞表面受體并激活一系列的細胞內的信號轉導通路，進而影響細胞間的相互作用，最終產生組織程度上的生理和病理學的變化。對于糖尿病而言，其所導致的血管病變主要為炎性黏附性增大引發的血栓和動脈粥樣硬化，其過程與單核細胞在病變部位內皮細胞上的黏附與運動過程密切相關，并且在體內條件下，這一過程還要涉及到血液流動所產生的生物物理學因素?？装鍖嶒灪茈y在體外構建集成有流體剪切力這一生物物理學因素的糖尿病血管病變模型，所以想模擬和重現上述糖尿病所致血管病變的過程是比較困難的。微流控芯片實驗室又稱芯片實驗室或微流控芯片，指的是把生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離、檢測、細胞培養、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網絡，以可控流體貫穿整個系統，用以取代常規化學或生物實驗室的各種功能的一種技術。微流控芯片技術作為一門迅速發展起來的科學技術，已經在生物醫學領域展現了其獨特的優勢，更因其同細胞尺寸匹配、環境同生理環境相近、在時間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設計實現多種細胞功能研究等特點而成為新一代生物仿生和細胞研究的重要平臺。目前，利用微流控芯片進行組織工程的模擬，尤其是糖尿病血管病變的模擬以及單核細胞在病變部位表面的運動特征研究分析還處于空白階段
技術實現思路
本專利技術的目的是提供，并應用于單核細胞在病變部位表面運動特征的研究，特別針對單核細胞在病變部位表面的黏附與滾動的特點，該方法具有對細胞運動實時監測的特點，同時能夠實現對細胞運動速度和軌跡的準確表征。本專利技術提供了一種微流控芯片，該微流控芯片主要由細胞入口池(I)、細胞培養室(2)和出口池(3)組成，細胞培養室(2)上連細胞入口池(I)，細胞培養室(2)下連出口池⑶。本專利技術提供的微流控芯片，該微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為可透光透氣的PDMS聚合物，下層材料為濃硫酸煮過的潔凈玻璃。所述微流控芯片的上下兩層分別進行紫外過夜照射的滅菌處理，然后等離子體處理30-45S進行封接。本專利技術還提供了，基本過程如下(I)芯片修飾用移液器將配制好的膠原工作液經由細胞入口池加入芯片，將固定芯片的培養皿常溫靜置過夜，12-36小時(優選24小時)之內移除膠原工作液，細胞培養液沖洗通道2-4次(優選3次)，對通道底面進行修飾，促進人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)更好地貼壁；(2)芯片內細胞的接種與培養HUVEC細胞消化后，調整至合適的細胞密度(細胞密度為5X106cellS/mL)，經由細胞入口池加入到芯片中，在膠原的修飾作用下，細胞迅速貼壁并均勻鋪展于細胞培養室底面，當在光學顯微鏡下觀察到細胞在細胞培養室中均勻分布時，立即將芯片移入二氧化碳培養箱中繼續培養；(3)糖尿病血管病變模型的建立待HUVEC細胞經過增殖完全鋪滿細胞培養室底面后，經由細胞入口池分別向4個通道中通入不含血清的細胞培養液并繼續培養24-36小時(優選24小時)，使HUVEC細胞處于相同的生長期，隨后分別依次向4個通道中通入含有不同葡萄糖濃度的細胞培養液繼續48小時，模擬糖尿病患者血管壁所處的高糖環境。本專利技術建立的糖尿病血管病變模型的芯片內細胞活性考察及血管病變部位細胞表面結構與功能變化的表征，方法過程如下(I)用碘化丙啶表征培養兩天后細胞的生長狀態及活性；(2)常規免疫熒光染色法表征高糖作用后的HUVEC細胞內及細胞表面eNOS、vWF、ICAM-UVCAM-Uintegrin-^ 4以及粘著斑蛋白的表達(蛋白表達檢測的方法為細胞免疫熒光染色)，用于表征糖尿病血管病變部位相應結構和功能的變化，主要表征細胞表面粘附性的變化。本專利技術還提供了上述建立的糖尿病血管病變模型應用于單核細胞在內皮細胞表面的黏附與滾動現象的研究，方法過程如下將培養48-72小時的白血病單核細胞稀釋成I X 106-5 X 106cells/mL的細胞懸液，置入二氧化碳培養箱中備用；將不同葡萄糖濃度培養液刺激后的糖尿病血管病變模型芯片取出，經由細胞入口池以一定的流速通入單核細胞的細胞懸液，顯微鏡持續拍攝單核細胞在HUVEC細胞表面的黏附與滾動現象(每隔50ms拍照一張，共拍攝80張，具體實時監測時間為4s),統計發生粘附與滾動的單核細胞數目，通過Image ProPlus軟件分析單核細胞運動的速度與軌跡。本專利技術提供的基于微流控芯片的糖尿病血管病變模型的建立方法，并應用于單核細胞在病變部位表面的運動特征研究，可采用生物學上常用的細胞檢測手段對內皮細胞以及單核細胞進行檢測，包括細胞死活標記染色、細胞免疫熒光染色、細胞運動速度和距離的檢測等。附圖說明圖I本專利技術微流控芯片整體結構示意圖；圖2本專利技術微流控芯片通道內，HUVEC細胞的貼壁與鋪展情況；圖3含不同葡萄糖濃度的細胞培養液刺激HUVEC細胞48h后，碘化丙啶染色表征HUVEC細胞的增殖與凋亡情況； 圖4含不同葡萄糖濃度的細胞培養液刺激HUVEC細胞48h后，免疫熒光染色法檢測HUVEC細胞內及細胞表面相應結構和功能蛋白的表達變化，其中，a顯示的是在含不同葡萄糖濃度培養液的刺激下，HUVEC細胞表面eNOS、vWF、Int ^ 4表達量的變化，b顯示的是在含不同葡萄糖濃度培養液的刺激下，HUVEC細胞表面vinculin、VCAM-l、ICAM-I表達量的變化；圖5不同流體剪切力作用下單核細胞在內皮細胞表面的黏附與滾動情況，其中，a顯示的是在流體剪切力FSS=O. 2dyne/cm2的條件下，單核細胞在HUVEC細胞表面的滾動與粘附現象，b顯示的是在流體剪切力FSS=O. 4dyne/cm2的條件下，單核細胞在HUVEC細胞表面的滾動與粘附現象。具體實施例方式下面的實施例將對本專利技術予以進一步的說明，但并不因此而限制本專利技術。實施例I應用HUVEC細胞建立糖尿病血管病變模型利用實驗室自行設計制作的微流控芯片，結構如圖I所示。配制濃度為100 U g/mL的I型鼠尾膠原工作液，經由細胞入口池注入芯片內，常溫靜置過本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種微流控芯片，其特征在于：該微流控芯片主要由細胞入口池(1)、細胞培養室(2)和出口池(3)組成；細胞培養室(2)上連細胞入口池(1)，細胞培養室(2)下連出口池(3)。

【技術特征摘要】
1.一種微流控芯片，其特征在于該微流控芯片主要由細胞入口池(I)、細胞培養室(2)和出口池(3)組成；細胞培養室(2)上連細胞入口池(I)，細胞培養室(2)下連出口池⑶。2.按照權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為可透光透氣的PDMS聚合物，下層材料為濃硫酸煮過的潔凈玻璃。3.按照權利要求2所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片的上下兩層分別進行紫外過夜照射的滅菌處理，然后等離子體處理30-45S進行封接。4.一種基于權利要求I所述微流控芯片的糖尿病血管病變模型的建立方法，其特征在于方法過程如下 (1)芯片修飾 用移液器將配制好的膠原工作液經由細胞入口池加入芯片，將固定芯片的培養皿常溫靜置過夜，12-36小時之內移除膠原工作液，細胞培養液沖洗通道2-4次，對通道底面進行修飾，促進人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)更好地貼壁； (2)芯片內細胞的接種與培養 HUVEC細胞消化后，調整至合適的細胞密度，經由細胞入口池加入到芯片中，在膠原的修飾作用下，細胞迅速貼壁并均勻鋪展于細胞培養室底面，當在光學顯微鏡下觀察到細胞在細胞培養室中均勻分布時，立即將芯片移入二氧化碳培養箱中繼續培養； (3)糖尿病血管病變模型的建立 待HUVEC細胞經過增殖完全鋪滿細胞培養室底面后，經由細胞入口池分別向4個通道中通入不含血清的細胞培養液并繼續培養24-36小時，使HUVEC細胞處于相同的生長期，隨后分別依次向4個通道中通入含有不同葡萄糖濃度的細胞培養液繼續48小時，模擬糖尿病患者血管壁所處的高糖環境。5.按照權利要求4所述的基于微流控芯片的糖尿病血管病變模...

【專利技術屬性】
技術研發人員：秦建華，許慧，馬慧朋，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：