本發明專利技術提供了一種基于微流控芯片的體外血腦屏障模型的建立與表征方法，該微流控芯片主要包括細胞入口池(1)、膠原入口池(2)、細胞培養室(3)和廢液池(4)，細胞培養室(3)上連細胞入口池(1)，細胞培養室(3)下連廢液池(4)，每個膠原入口池分別含有4個觀察小室，膠原入口池與細胞培養室(3)聯通。本發明專利技術將體外血腦屏障模型的構建與表征、屏障功能的評價集成到一塊幾平方厘米的芯片上，可以用于血腦屏障模型的體外模擬及后續應用。本發明專利技術與Transwell小室細胞共培養模型相比，解決了細胞共培養模型二次接種和耗時長的問題，添加入流動條件，更接近體內真實微環境，而且顯著降低了細胞和試劑消耗量，并可以單次同時獲得多個實驗相關參數。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及將微流控芯片技術應用到體內組織工程的模擬與應用領域，具體涉及一種。
技術介紹
1885年德國人PaulEhrlich第一次證明了腦血管的通透性與非神經性血管不同，其后的研究者們相繼認識到血和腦之間有屏障存在，并稱之為血-腦屏障。血腦屏障是一個以腦微血管內皮細胞、星形膠質細胞和周細胞共同構成的結構的和功能的屏障，它調節分子進出大腦以維持神經的微環境。很多腦內的疾病都與血腦屏障的防御功能被破壞有關，藥物又無法順利通過血腦屏障。因此，建立體外血腦屏障模型，研究血腦屏障的結構和功能特性、對各種化學成分的轉運能力及其損傷和防御功能被破壞的機制，對于進一步研究血腦屏障的功能原理，認識腦部感染和藥物的轉運機制，以及由于屏障功能失效造成的腦損傷和疾病和如何進行藥物治療有著重大意義。細胞生物學發展至今,主要的培養和研究依賴于的是孔板和商品化的Transwell小室，集中觀察單一或者多種因素刺激下的細胞形態變化、生長過程、遷移和增殖行為等。現有的體外血腦屏障的模擬方法主要集中于商品化的孔板或Transwell小室，研究二維層面血腦屏障模型的結構和功能，主要存在的問題是孔板或者Transwell小室很難在體外構建存在二維平面到三維空間的界面轉換的血腦屏障模型，難以實現間充質干細胞穿越血腦屏障進行腦內腫瘤治療的原位觀察。微流控芯片技術作為一門迅速發展起來的科學技術，已經在生物醫學領域展現了其獨特的優勢，更因其同細胞尺寸匹配、環境同生理環境相近、在時間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設計實現多種細胞功能研究等特點而成為新一代細胞研究的重要平臺。它對于實驗結果能夠實時追蹤和原位觀察，不僅能夠獲得最終結果，也可以得到細胞遷移過程中出現的暫時性信息，為間充質干細胞穿越血腦屏障過程的研究提供常規分析中有可能缺失的重要生物學信息。而目前，利用微流控芯片進行間充質干細胞穿越血腦屏障，尤其是從二維平面遷移運動到三維基質過程的研究分析還處于空白階段。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種基于微流控芯片的血腦屏障模型的建立與表征方法，該方法能夠實現觀測血腦屏障形成過程中的結構和功能的變化。本專利技術提供了一種微流控芯片，該微流控芯片主要由細胞入口池(I)、膠原入口池(2)、細胞培養室(3)和廢液池(4)組成；細胞培養室(3)上連細胞入口池(I)，細胞培養室(3)下連廢液池(4)，每個膠原入口池分別含有4個觀察小室，膠原入口池利用不同高度液體表面張力的差異與細胞培養室(3)聯通。本專利技術提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為可透光透氣的PDMS聚合物，下層材料為濃硫酸煮過的潔凈玻璃。本專利技術提供的微流控芯片，所述微流控芯片的上下兩層分別進行紫外過夜照射的滅菌處理，然后等離子體處理30-45S進行封接。本專利技術提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的兩部分組成(I)、⑶、⑷的高度約為⑵高度的三倍；其中，⑴、⑶、⑷的高度為150 iim，⑵的高度為50 u m0本專利技術還提供了一種基于所述微流控芯片的血腦屏障模型的建立和表征方法，方法過程如下(I)腦膠質瘤細胞條件培養液的制備將腦膠質瘤細胞消化后，以一定濃度接種入6孔板，恒溫培養箱中培養24-36小時之后，棄去培養液，向孔板中加入無血清細胞培養液，恒溫培養箱中繼續培養48小時，收集該培養液備用；(2)芯片內膠原的灌注用移液器將配制好的膠原工作液注入膠原入口池(2)，將固定芯片的培養皿放入恒溫培養箱中孵育30-45分鐘，促使通道內膠原由粘稠狀液體變為果凍狀凝膠，凝膠結束后，細胞入口池(I)、細胞培養室(3)和廢液池(4)中加入新鮮的細胞培養液；(3)芯片內細胞接種及血腦屏障模型的建立人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)經消化后，調整細胞密度為5X106-lX107Cells/mL，取10-20 ii L細胞懸液加入細胞入口池(I)內，從廢液池端迅速吸出10-20ii L細胞培養液，促使細胞在重力流的作用下快速、均勻地進入細胞培養室(3);當在光學顯微鏡下觀察到細胞培養室(3)中的細胞均勻分布時，立即將芯片豎立，并移入恒溫培養箱中放置，豎立方向為細胞培養室(3)在上，膠原入口池(2)在下；豎立放置8min后，取出觀察，如果細胞緊貼于細胞觀察室交界面，說明細胞接種成功；將芯片放平，向通道加入先前收集的腦膠質瘤細胞的條件培養液，移入恒溫培養箱中繼續培養48-60小時，每隔12-24小時換液一次；(4)血腦屏障模型的結構表征及功能評價常規免疫熒光染色法表征模型細胞表面緊密連接蛋白的表達；以小分子(MW=557. 47)熒光物質為探針，表征血腦屏障模型的滲透性，向細胞入口池(I)內加入小分子熒光物質溶液，分別測定0min、15min、30min后膠原入口池的4個觀察室內的熒光強度。本專利技術提供的基于微流控芯片的血腦屏障模型的建立和表征方法，血腦屏障模型建立時，應用腦膠質瘤細胞的條件培養液對內皮細胞進行刺激，使其形成類似血腦屏障的細胞間緊密連接。本專利技術提供的基于微流控芯片的血腦屏障模型的建立和表征方法，所述膠原為I型鼠尾膠原，常溫下它是呈粘稠狀的液體，當pH=7，溫度達到37°C的情況下，孵育30min，即可呈現果凍狀的凝膠。本專利技術提供的基于微流控芯片技術的血腦屏障模型的建立和表征方法，血腦屏障結構和功能的表征可采用生物學上常用的細胞檢測手段對血腦屏障模型細胞進行檢測，包括常規細胞免疫熒光染色。本專利技術將體外血腦屏障模型的構建與表征、屏障功能的評價集成到一塊幾平方厘米的芯片上，可以用于血腦屏障模型的體外模擬及后續應用。本專利技術與Transwell小室細胞共培養模型相比，解決了細胞共培養模型二次接種和耗時長的問題，添加入流動條件，更接近體內真實微環境，而且顯著降低了細胞和試劑消耗量，并可以單次同時獲得多個實驗相關參數。附圖說明圖I本專利技術微流控芯片整體結構示意圖；其中，黑色區域的芯片高度為150i!m，灰色區域的芯片高度為50iim;圖2微流控芯片膠原加入后形成的二維平面與三維基質的清晰界面及三維基質均勻膠絲；圖3芯片細胞接種后豎立IOmin時的細胞對三維基質膠的貼附情況； 圖448小時之后血腦屏障的形成情況；圖5細胞間緊密連接蛋白ZO-I的表達情況，其中，a顯示的為160倍放大條件下，ZO-I蛋白的表達情況，b為a圖的局部放大效果圖；圖6血腦屏障滲透性表征，其中，a顯示的為小分子熒光物質滲透的實時監測圖，b顯示的為a圖滲透性的數據統計，說明隨時間的延長，滲透過血腦屏障模型的熒光物質的量變增大。具體實施例方式下面的實施例將對本專利技術予以進一步的說明，但并不因此而限制本專利技術。實施例IHUVEC細胞在三維膠原表面緊密融合形成血腦屏障及結構表征利用實驗室自行設計制作的微流控芯片，構型如圖I所示。配制濃度為3mg/mL的膠原原液，按每孔0. L加入到膠原入口池中，37°C凝膠30min，形成的膠絲分布如圖2所示。從細胞入口池加入HUVEC細胞懸液10-20 iiL，細胞懸液濃度為5X IO6-IX IO7Cells/mL,豎立芯片lOmin，使細胞貼附在膠原一側，如圖3所示，拍照記錄細胞初始位置。每隔24h換液一次，并拍照記錄HUVEC細胞融合情況，如圖4所示。48小時后，進行本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種微流控芯片，其特征在于：該微流控芯片主要包括細胞入口池(1)、膠原入口池(2)、細胞培養室(3)和廢液池(4)；細胞培養室(3)上連細胞入口池(1)，細胞培養室(3)下連廢液池(4)，每個膠原入口池分別含有4個觀察小室，膠原入口池與細胞培養室(3)聯通。
【技術特征摘要】
1.一種微流控芯片，其特征在于該微流控芯片主要包括細胞入口池(I)、膠原入口池(2)、細胞培養室(3)和廢液池(4);細胞培養室(3)上連細胞入口池(I)，細胞培養室(3)下連廢液池(4)，每個膠原入口池分別含有4個觀察小室，膠原入口池與細胞培養室(3)聯通。2.按照權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為可透光透氣的PDMS聚合物，下層材料為濃硫酸煮過的潔凈玻璃。3.按照權利要求2所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片的上下兩層分別進行紫外過夜照射的滅菌處理，然后等離子體處理45-60S進行不可逆封接。4.按照權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片是由高度不同的兩部分組成，細胞入口池(I)、細胞培養室(3)、廢液池(4)高度為膠原入口池(2)高度的三倍。5.按照權利要求4所述的微流控芯片，其特征在于所述膠原入口池(2)高度約為50iim;細胞入口池(I)、細胞培養室(3)、廢液池(4)高度為150 iim。6.一種基于權利要求I所述的微流控芯片的血腦屏障模型的建立與表征方法，其特征在于方法過程如下 (1)腦膠質瘤細胞條件培養液的制備 將腦膠質瘤細胞消化后，以5 X IO5-I X IO6ceIlsAiL密度接種入6孔板，恒溫培養箱中培養24-36小時之后，棄去培養液，向孔板中加入無血清細胞培養液，恒溫培養箱中繼續培養48小時，收集該培養液備用； (2)芯片內膠原的灌注 用移液器將配制好的膠原工作液注入膠原入口池(2)，將固定芯片的培養皿放入恒溫培養箱中孵育30-45分鐘，促使通道內膠原由粘稠狀液體變為果凍狀凝膠，凝膠結束后，細胞入口池(I)、細胞培養室(3)和廢液池(4)中加入新鮮的細胞培養液； (3)芯片內細胞接種及血腦屏障模型的建立 人臍靜...
【專利技術屬性】
技術研發人員：秦建華，許慧，馬慧朋，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：
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