本發明專利技術屬生物技術領域，涉及一種狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統及其制備方法。本發明專利技術采用狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29作為腦靶向頭基，陽離子樹枝狀大分子為載體材料，通過親水性聚合物連接RVG29多肽構建腦靶向載體；腦靶向載體再通過靜電復合作用與編碼特定基因的質粒DNA復合，制成所述的腦靶向納米基因遞釋系統。本發明專利技術能增加納米基因遞釋系統在體外血腦屏障模型的攝取和穿過效率，提高納米基因遞釋系統在動物腦內的蓄積，提高報告基因在腦內的表達量，實現基因跨過血腦屏障向腦內的遞釋，為診斷和治療基因的腦部應用提供了一種高效和安全的策略。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術 屬生物
，涉及一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統，具體涉及一種狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統及其制備方法。
技術介紹
研究顯示，血腦屏障的存在對于維持中樞神經系統的穩態有著至關重要的作用，但同時，其也阻礙了診斷或治療藥物向腦內的有效遞送。現代醫學研究證實，血腦屏障的主要成分是腦毛細血管內皮細胞，其特點是細胞間有致密的緊密連接，絕大多數物質難以通過；而另外一方面，一些內源性的蛋白等營養物質可通過結合特定受體，利用受體介導的穿細胞作用，跨過血腦屏障，到達腦內；此外，一些病原體如狂犬病毒也可通過特定的受體，跨過血腦屏障，引起腦內感染。有研究發現，一種由狂犬病毒糖蛋白衍生的29個氨基酸的多肽RVG29保留了與血腦屏障上特異受體結合的特性，因此采用RVG29多肽修飾藥物遞釋系統，可實現高效的腦靶向遞釋；并且由于神經元細胞也表達有特異性的受體，RVG29修飾的藥物遞釋系統跨過血腦屏障后，將有利于進一步靶向神經元，對于治療神經系統疾病如神經退行性疾病等有重要意義。聚酰胺胺樹枝狀分子(PAMAM)是近年來發展應用的一類新型陽離子樹枝狀聚合物大分子，其特征為納米級的尺寸，表面有豐富氨基，一方面有利于進行進一步的修飾，另一方面由于其在生理條件下帶有正點荷，可與負電性的質粒DNA復合，通過靜電相互作用自組裝成載基因納米粒，起到保護質粒DNA在循環過程中不被酶類降解。有研究表明，通過親水性聚合物可將陽離子樹枝狀大分子與腦靶向多肽進行連接，同時親水性聚合物也可延長載基因納米粒在體內的循環時間，減少網狀內皮系統的非特異性攝取，減少非靶組織的攝取，進而降低給藥系統的副作用。但目前腦部基因遞釋存在的種種局限，現急需一種新型的腦靶向納米基因遞釋系統，該遞釋系統可增加納米基因遞釋系統在體外血腦屏障模型的攝取和穿過效率，提聞納米基因遞釋系統在動物腦內的畜積，進而提聞報告基因在腦內的表達量，實現基因跨過血腦屏障向腦內的遞釋。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統，尤其是一種狂犬病毒糖蛋白衍生多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統及其制備方法。本專利技術的遞釋系統為一種新型的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29修飾的陽離子樹枝狀大分子包載基因的腦靶向納米基因遞釋系統。本專利技術利用陽離子樹枝狀大分子材料的高度分枝特性，在其表面進行聚乙二醇PEG化修飾，既作為連接劑，利于后續靶向多肽的修飾，也可中和陽離子樹枝狀大分子表面的正電性，以降低其毒性，延長基因遞釋系統在體內的循環時間，同時使用極具臨床應用潛力的腦靶向頭基——RVG29多肽修飾陽離子樹狀大分子材料，增加納米基因遞釋系統在體外血腦屏障|旲型的攝取和穿過效率，提聞納米基因遞釋系統在動物腦內的畜積，進而提聞報告基因在腦內的表達量，實現基因跨過血腦屏障向腦內的遞釋。具體而言，本專利技術的一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統，其特征在于，由腦靶向載體和編碼特定基因的質粒DNA構成，所述的腦靶向載體由陽離子樹狀大分子材料、親水性聚合物和RVG29組成。本專利技術中，采用狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29作為腦靶向頭基，陽離子樹枝狀大分子為載體材料，通過親水性聚合物連接RVG29多肽構建新型腦靶向載體；所述的腦靶向載體再進一步通過靜電復合作用與編碼特定基因的質粒DNA復合，制成腦靶向納米基因遞釋系統。其中，所述的腦靶向載體為RVG29修飾的樹枝狀大分子腦靶向載體，是以陽離子樹枝狀大分子材料、親水性聚合物和RVG29多肽為組分，三者以共價方式連接制成；所述的親水性聚合物與陽離子樹狀大分子材料的分子比是I 20 I ；所述的RVG29多肽與陽離子樹狀大分子材料的分子比為I 10 : I ;所述的腦靶向載體與質粒DNA復合的質量之比是3 10 I ；所述的狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29多肽(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)，具有SEQ ID NO. I的序列。本專利技術中，所述的腦靶向載體通過下述方法制備陽離子樹枝狀大分子材料和親水性聚合物以I : I 20的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應60 180分鐘，兩種分子中含有的基團發生特異性反應，生成陽離子樹枝狀大分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應的親水性聚合物并更換為pH值6. 8 7. 2磷酸鹽緩沖液；同時，RVG29多肽以I 10 I的分子比與陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物上的特異基團室溫攪拌反應12 36小時后生成陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物-RVG29，分子排阻色譜法除去未反應的RVG29多肽，制得腦革El向載體。本專利技術中，所述的陽離子樹枝狀大分子材料選自樹枝狀聚賴氨酸(dendrigraftpoly-L-lysines DGLs,簡稱 DGLs)和聚酸胺-胺(polyamidoamine,簡稱 PAMAM)；所述的親水性聚合物為聚乙二醇(polyethyleneglycol,簡稱PEG)。本專利技術中，將質粒DNA溶于50mM硫酸鈉溶液中，所述腦載體溶液與DNA溶液以摩爾比3 10 I混合后，渦旋30s，制得腦靶向納米基因遞釋系統。本法明的腦靶向納米基因遞釋系統適用于將特定基因質粒經靜脈給藥形成，通過血腦屏障，遞釋入腦內。本專利技術采用氫核磁共振技術對腦靶向載體進行結構鑒定，結果顯示，所述的樹狀大分子與含有雙功能基團的PEG (琥珀酰亞胺-PEG3500-馬來酰亞胺)反應后在3. 6ppm處出現PEG的特征吸收峰，表明樹狀大分子-PEG合成成功；樹狀大分子-PEG進一步與RVG29多肽反應后在2. 2ppm至3. 3ppm出現RVG29與PAMAM的質子峰，證明腦靶向載體三個成分均已連接成功。本專利技術通過瓊脂糖凝膠電泳對腦靶向載體包載質粒DNA的能力進行驗證，結果顯示，在載體與質粒DNA的質量比在10 I時，未見明顯DNA遷移，表明腦靶向載體可對質粒DNA進行完全包封，起到保護DNA的目的。本專利技術的腦靶向基因遞釋系統與未修飾腦靶向頭基的系統包載熒光標記的質粒DNA后，分別孵育腦毛細血管內皮細胞，熒光顯微鏡觀察結果顯示，腦靶向組的攝取明顯高于非靶向組，且所述的攝取依賴于RVG29多肽修飾。本專利技術的腦靶向基因遞釋系統孵育腦毛細血管內皮細胞后，對于內涵體進行染色，顯示腦靶向基因遞釋系統主要通過內吞途徑進入細胞。 本專利技術通過體外血腦屏障模型驗證了放射標記的腦靶向基因遞釋系統的穿越腦毛細血管內皮細胞單層膜的效率顯著過于非靶向組，而與此同時在實驗整個過程中由腦毛細血管內皮細胞組成的單層血腦屏障模型保持完整。本專利技術利用活體成像儀考察腦靶向基因遞釋系統在裸鼠體內分布特性，經尾靜脈給藥后，結果顯示腦靶向組在腦部的蓄積明顯高于非靶向組，結果表明，RVG29多肽可高效的介導腦靶向基因遞釋系統的入腦。本專利技術所制備的載有報告基因綠熒光蛋白的腦靶向納米基因遞釋系統經尾靜脈給藥后，表達48小時進行灌流和冰凍腦切片，熒光顯微鏡下觀察綠熒光蛋白在腦內各區域的表達，結果顯示，RVG29多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統可有效的介導報告基因在腦部各主要區域包括皮層、海馬、紋狀體和黑質的表達，表達量高于未修飾RVG29多肽的非靶向組。本專利技術所制備的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統，其特征在于，由腦靶向載體和編碼特定基因的質粒DNA構成，所述的腦靶向載體由陽離子樹狀大分子材料、親水性聚合物和狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG29組成。
【技術特征摘要】
1.一種多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統，其特征在于，由腦靶向載體和編碼特定基因的質粒DNA構成，所述的腦靶向載體由陽離子樹狀大分子材料、親水性聚合物和狂犬病毒糖蛋白衍生妝RVG29組成。2.按權利要求I所述的多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統，其特征在于，所述的腦革巴向載體為RVG29修飾的樹枝狀大分子腦祀向載體，其中，以陽尚子樹枝狀大分子材料、未水性聚合物和RVG29多肽為組分，三者以共價方式連接。3.按權利要求I所述的多肽修飾的腦靶向納米基因遞釋系統，其特征在于，所述的腦靶向載體通過靜電與編碼特定基因的質粒DNA復合。4.按權利要求I或2所述的腦靶向納米基因遞釋系統，其特征在于，所述的腦靶向載體通過下述步驟制備 陽離子樹枝狀大分子材料和親水性聚合物以I : I 20的分子比溶于pH值7. 8 8.2磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應60 180分鐘，生成陽離子樹枝狀大分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應的親水性聚合物并更換為pH值6. 8 7. 2磷酸鹽緩沖液；同時，RVG29多肽以I 10 : I的分子比與陽離子樹狀大分子材料-親水性聚合物上的特異基團室溫攪拌反應12 36小時后...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣晨，劉洋，
申請(專利權)人：復旦大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。