賴氨酸芽孢桿菌及其降解MC-LR的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)賴氨酸芽孢桿菌及其降解MC-LR的方法，屬于環(huán)保水處理技術(shù)領(lǐng)域。提供了紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillusfusiformis），保藏編號為CGMCCNO.6107。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了利用紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillusfusiformis）菌種降解MC-LR的方法。賴氨酸芽孢桿菌能與藍(lán)藻共生，能夠適應(yīng)自然環(huán)境，且該菌對MC-LR的分解利用具有專一性，外加碳源能夠較大程度地促進(jìn)其降解作用，對于利用微生物法去除長期遭受藍(lán)藻水華污染的大面積水體中的MC-LR具有較廣闊的應(yīng)用前景。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于環(huán)保水處理
，具體涉及一種從太湖流域藍(lán)藻藻漿壓濾液中篩選的1株賴氨酸芽孢桿菌及利用其降解微囊藻毒素-LR（MC-LR）的方法。
技術(shù)介紹
近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工、農(nóng)業(yè)已呈現(xiàn)大規(guī)模機械化，作業(yè)過程中產(chǎn)生的大量含氮磷廢水皆就近排入附近河流、湖泊等水體，帶來的富營養(yǎng)化問題已日趨嚴(yán)重，藍(lán)藻水華頻繁暴發(fā)。據(jù)研究報道，25%-70%的藍(lán)藻水華污染可產(chǎn)生微囊藻毒素（MCs）。MCs是一類環(huán)狀七肽肝毒素，具有90多種同分異構(gòu)體，其中微囊藻毒素-LR（MC-LR）和微囊藻毒素-RR（MC-RR）是我國藍(lán)藻水華水體中出現(xiàn)頻率及含量較高的兩種類型。MCs在水中的溶解度大于1.0?g/L，不易被沉積物、懸浮顆粒物吸附，幾乎全部以溶解性狀態(tài)分布于水體中，可在水生生物體內(nèi)富集，并通過食物鏈進(jìn)入人體，低劑量的MC-LR即可引發(fā)原發(fā)性肝癌、大腸癌、胰腺癌等疾病，嚴(yán)重危害人類健康，世界衛(wèi)生組織和我國的飲用水標(biāo)準(zhǔn)均規(guī)定了MC-LR不超過1.0?μg/L的限值。MC-LR因具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在自然條件下降解過程非常緩慢，且具有熱穩(wěn)定性，煮沸30?min也不能破壞其毒性，常規(guī)水處理工藝對其去除率較低。目前，去除MC-LR的方法主要有化學(xué)法、物理法和生物法等，其中微生物降解法是公認(rèn)的最為安全有效的方法。據(jù)公開研究報道，能夠降解MC-LR的微生物種類稀少，種群結(jié)構(gòu)單一，僅局限于某些特殊菌株。如公開號為CN1785851的專利技術(shù)專利，從滇池底泥中篩選出1株降解MCs的食酸戴爾福特菌?！掇r(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報》2009年第28卷第8期1669-1675頁報道了楊靜東等采用從太湖水華藍(lán)藻細(xì)胞中提取的MCs作為微生物生長的唯一碳源和氮源，從富營養(yǎng)化的太湖水體中篩選出降解MCs的微生物菌群。公開號為CN102154170的專利技術(shù)專利，是本專利技術(shù)人從太湖河浜底泥中篩選出1株降解MC-LR的球形芽孢桿菌。但目前已報道的MC-LR降解菌僅在特定條件下表現(xiàn)出高效性，常用外加碳源對其降解性能多具有抑制作用，菌劑制備碳源選擇受限，以致于MC-LR降解菌在實際工程中的應(yīng)用難以大規(guī)模實現(xiàn)。根據(jù)生物進(jìn)化論適者生存的原理，藍(lán)藻水華水體中可能存在與藍(lán)藻共生的細(xì)菌，本專利技術(shù)以取自常州雪堰鎮(zhèn)藻水分離站的太湖藍(lán)藻藻漿壓濾液作為MC-LR降解菌的來源，通過馴化、富集、分離純化，從中篩選出1株具有MC-LR降解能力的賴氨酸芽孢桿菌。本專利技術(shù)提供的這株賴氨酸芽孢桿菌對MC-LR的分解利用具有專一性，常用外加碳源能夠促進(jìn)其降解MC-LR，因此，這種與藍(lán)藻共生的細(xì)菌在天然水體中更易繁殖，且能成為優(yōu)勢菌種，在藍(lán)藻水華污染治理中的應(yīng)用前景更為廣闊。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，針對MC-LR難以有效去除的難題而提供的一種從藍(lán)藻藻漿壓濾液中篩選的對MC-LR分解利用具有專一性的賴氨酸芽孢桿菌，并利用其降解MC-LR的方法。本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案如下：本專利技術(shù)提供了MC-LR降解菌R3，建議的分類命名為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus?fusiformis）。已于2012年5月11日保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號為CGMCC?NO.6107。利用上述菌種降解MC-LR的方法，按照下述步驟進(jìn)行：將紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus?fusiformis）單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中于溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速130?r/min條件下培養(yǎng)20?h至對數(shù)期，再按照體積分?jǐn)?shù)5%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)20?h至對數(shù)期，備用。將上述對數(shù)期賴氨酸芽孢桿菌按照投菌量為2-10%（以體積分?jǐn)?shù)計）的比例接種到以MC-LR為唯一碳源、pH值為5.0-9.0的無機鹽培養(yǎng)基中，在30℃搖床轉(zhuǎn)速130?r/min下培養(yǎng)7?d即能夠有效地降解MC-LR。上述降解MC-LR的方法優(yōu)選：以體積分?jǐn)?shù)計為4-6%的投菌量接種到以MC-LR為唯一碳源、pH值為7.0的無機鹽培養(yǎng)基中，在30℃搖床轉(zhuǎn)速130?r/min下培養(yǎng)7?d。其中所述的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基組成如下：蛋白胨10?g，牛肉膏3?g，NaCl?5?g；蒸餾水1000?mL，pH?7.2-7.4。其中所述的無機鹽培養(yǎng)基組成如下：K2HPO4?1.6?g，KH2PO4?0.4?g，NH4Cl?0.5?g，MgSO4·7H2O?0.2?g，CaCl2·2H2O?25?mg，F(xiàn)eCl3·6H2O?2.3?mg，適量MC；蒸餾水1000?mL，pH?7.2-7.4。本專利技術(shù)的主要優(yōu)點：1、本專利技術(shù)選用價廉易得的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分離篩選、純化MC-LR降解菌，具有成本低、安全、高效等優(yōu)點。2、本專利技術(shù)選擇太湖藍(lán)藻藻漿壓濾液作為MC-LR降解菌的菌種分離源，所篩選出的1株賴氨酸芽孢桿菌能與藍(lán)藻共生，能夠適應(yīng)自然環(huán)境，且該菌對MC-LR的分解利用具有專一性，外加碳源能夠較大程度地促進(jìn)其降解作用，對于利用微生物法去除長期遭受藍(lán)藻水華污染的大面積水體中的MC-LR具有較廣闊的應(yīng)用前景。具體實施方式菌株的篩選及鑒定：1、樣品采集以取自常州市雪堰鎮(zhèn)藻水分離站的太湖藍(lán)藻藻漿壓濾液作為MC-LR降解菌的菌種分離源。篩選降解菌用到的MC-LR是在實驗室條件下從太湖藍(lán)藻細(xì)胞中提取、提純的。2、培養(yǎng)基配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：稱取牛肉膏3?g，蛋白胨10?g及NaCl?5?g于燒杯中，加入蒸餾水1000?mL，在電爐上加熱，并攪拌，使之快速溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，然后分別取100?mL培養(yǎng)基于錐形瓶中，用紗布和牛皮紙將錐形瓶封好，放入高壓鍋中121℃滅菌20?min。固體培養(yǎng)基加入瓊脂2.4%。無機鹽液體培養(yǎng)基：稱取K2HPO4?1.6g，KH2PO4?0.4?g，NH4Cl?0.5?g，MgSO4·7H2O?0.2?g，CaCl2·2H2O?25?mg，F(xiàn)eCl3·6H2O?2.3?mg，MC?49.07?μg于燒杯中，加入蒸餾水1000?mL，調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，于高壓鍋中121℃滅菌20?min。3、篩選方法將采集的水樣10?mL接入內(nèi)裝玻璃珠和90?mL無菌水且已滅菌的錐形瓶中，將該錐形瓶放入溫度30℃的搖床中，轉(zhuǎn)速130?r/min，搖勻，取10?mL接入50?mL以MC-LR作為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化培養(yǎng)4?d，共4次，逐次增加MC-LR的濃度。然后進(jìn)行倍比稀釋將樣品稀釋到10-5、10-6、10-7，采用涂布法進(jìn)行分離，每個梯度做3個平行。根據(jù)菌落形態(tài)、大小、顏色等挑選其中長勢較好的菌落，在以MC-LR為唯一碳源的固體培養(yǎng)基中劃線分離培養(yǎng)2-3?d，然后進(jìn)行純化培養(yǎng)，繼代5-6次，得到相對優(yōu)勢的MC-LR降解菌株。4、菌株形態(tài)及生理生化性能通過對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、染色反應(yīng)和生理生化測定，并根據(jù)科學(xué)出版社《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（2001本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus？fusiformis），保藏編號為CGMCC？NO.6107。

【技術(shù)特征摘要】
1.紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus?fusiformis），保藏編號為CGMCC?NO.6107。
2.利用權(quán)利要求1所述的紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus?fusiformis）菌種降解MC-LR的方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行：
將紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus?fusiformis）單菌落接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中于溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速130?r/min條件下培養(yǎng)20?h至對數(shù)期，再按照體積分?jǐn)?shù)5%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，相同條件下培...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張文藝，李秋艷，李仁霞，陳雪珍，占明飛，
申請(專利權(quán))人：常州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：