一株對草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一株具有固氮作用及高抗草甘膦能力的克雷伯氏細(xì)菌及其應(yīng)用。該菌株由甘蔗根際分離獲得，通過無氮培養(yǎng)基篩選、固氮酶活性測定、固氮酶基因nif?H擴(kuò)增及序列分析，確定其為聯(lián)合固氮菌；經(jīng)菌株形態(tài)、16S?rDNA序列分析，把該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella?sp.)細(xì)菌。菌株命名為GG08160。本發(fā)明專利技術(shù)菌株具有聯(lián)合固氮能力及降解無機(jī)磷的功能，對甘蔗幼苗生長具有顯著促進(jìn)作用，在草甘膦含量達(dá)250mM的培養(yǎng)基質(zhì)中仍能正常生長，具有高抗草甘膦的活性，具有良好的應(yīng)用前景，可作為植物生長的促生菌，同時(shí)為草甘膦的生物降解研究提供新的微生物資源或基因資源，為促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供資源和保障。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，具體地涉及一株具有固氮作用及高抗草甘膦能力的克雷伯氏細(xì)菌及其應(yīng)用。?
技術(shù)介紹
充分發(fā)揮農(nóng)業(yè)微生物資源寶庫的作用，積極發(fā)掘新的生防微生物資源是農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)研究的重要內(nèi)容。近年來，大量施用化肥、農(nóng)藥造成的資源浪費(fèi)及土壤、地下水體污染已引起了世界各國的廣泛重視。利用生物固氮是減少氮肥施用量最為有效的途徑，生物固氮資源的研究、開發(fā)和利用在我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位。聯(lián)合固氮效率雖不及共生固氮高，但其分布廣，受益作物多，因而是一類不可忽視的固氮體系。目前已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)具有重要價(jià)值的作物如甘蔗、水稻、小麥、玉米、牧草等禾本科植物均可與固氮菌進(jìn)行聯(lián)合固氮作用。聯(lián)合固氮菌除了能為宿主提供氮素以外，還同時(shí)具有分泌生長素、溶磷、增強(qiáng)植株抗病性、抗逆境等多方面的促進(jìn)植物生長的作用。針對長期單一施用化學(xué)肥料帶來的土壤肥力下降，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降和農(nóng)業(yè)環(huán)境污染加劇等一系列對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的負(fù)面影響，積極發(fā)掘和利用聯(lián)合固氮作用的潛力對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展更具特殊的意義。?草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型，廣譜滅生性除草劑，對40多種一年生，多年生，單子葉和雙子葉木本，草本植物有殺傷作用，對多年生草的地下組織破壞力尤強(qiáng)，廣泛用于橡膠園，果樹，茶園，桑園，甘蔗田和林業(yè)除草。草甘膦理化性質(zhì)穩(wěn)定，具有高效、廣譜、低毒、低殘留、不破壞土壤環(huán)境、對大多數(shù)植物具有滅生性等其它除草劑所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，是全世界除草劑使用量最大的品種之一。但是草甘膦在殺滅雜草的同時(shí)對農(nóng)作物同樣有著殺死作用，從而限制了其使用范圍和使用時(shí)間。草甘膦進(jìn)入植物體內(nèi)，抑制5一烯醇丙酮基莽草酸一3一磷酸合酶(EPSP合酶)，使植物不能合成它生存所必需的某些芳香氨基酸，導(dǎo)致植物死亡。而人及動物與植物的代謝不同不需要合成那些芳香氨基酸，因此草甘膦對人及動物安全。?生物降解是草甘膦降解的最主要途徑。許多微生物對草甘膦具有降解作用，草甘膦微生物降解的主要中間產(chǎn)物是毒性極低的氨甲基磷酸(AMPA)，最終產(chǎn)生為水、二氧化碳與磷酸。在自然環(huán)境中特別是在長期使用草甘膦等除草劑地區(qū)的土壤中，存在種類繁多的能耐受或降?解草甘膦的細(xì)菌。單株細(xì)菌降解草甘膦的研究從八十年代初開始，在根瘤菌科、節(jié)桿菌、肺炎克氏桿菌等均分離到草甘膦降解菌。在土壤、垃圾和水體樣品中也能分離到高抗或降解草甘膦的細(xì)菌菌株。若將來源于微生物的草甘膦抗性基因克隆后轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，可加強(qiáng)植物對草甘膦的抗性，或增加植物降解甘膦的能力，從而可解除草甘膦對農(nóng)作物的危害。如果能有高抗或降解草甘膦的農(nóng)作物出現(xiàn)，則既能大大地節(jié)省農(nóng)業(yè)生產(chǎn)費(fèi)用，又能極大地促進(jìn)草甘膦工業(yè)的發(fā)展。?
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)目的針對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐的實(shí)際問題和需要，篩選出對甘蔗生長具有顯著促進(jìn)作用，同時(shí)對草甘膦具有高抗活性的聯(lián)合固氮菌，為研制促甘蔗生長微生物菌劑及抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的研究、應(yīng)用提供新的微生物資源。?本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案?本專利技術(shù)所述的甘蔗內(nèi)生固氮菌屬于克雷伯氏菌（Klebsiella?sp.），該菌株已于2011年11月3日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC?No.5439。該菌株由甘蔗根際分離獲得，通過無氮培養(yǎng)基篩選、固氮酶活性測定、固氮酶基因nifH擴(kuò)增及序列分析，確定其為聯(lián)合固氮菌；經(jīng)菌株形態(tài)、16S?rDNA序列分析，把該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella?sp.)細(xì)菌。菌株命名為GG08160，其最適生長溫度為30℃，最適生長pH為7.0～7.2。?本專利技術(shù)菌株GG08160具有聯(lián)合固氮能力及降解無機(jī)磷的功能，對甘蔗幼苗生長具有顯著促進(jìn)作用，在草甘膦含量達(dá)250mM的培養(yǎng)基質(zhì)中仍能正常生長，具有高抗草甘膦的活性，具有良好的應(yīng)用前景，可作為植物生長的促生菌，同時(shí)可為草甘膦的生物降解研究提供新的微生物資源或基因資源，為促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供資源和保障。?附圖說明圖1菌株GG08160在不同濃度草甘膦液體培養(yǎng)基中的生長情況；?圖2菌株GG08160在Pikovaskaia’s培養(yǎng)基平板上的生長情況；圖3菌株GG08160對甘蔗組培苗生長的促進(jìn)作用(增加植株的干重)；圖4菌株GG08160對甘蔗組培苗生長的促進(jìn)作用(增加植株含氮量)；圖5菌株GG08160對甘蔗組培苗生長的促進(jìn)作用(植株長勢及聯(lián)合固氮效率)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本專利技術(shù)。?實(shí)施例1??本專利技術(shù)菌株的分離?稱取附著在甘蔗根表土5g放入45mL滅菌水中，搖床上180r/min，28℃恒溫振蕩30min分散微生物細(xì)胞，靜置10min，即得10-1稀釋液，用滅菌水10倍系列稀釋，各取100μL涂在Ashby培養(yǎng)基(成分為蔗糖10g，NaCl?0.2g，KH2PO4?0.2g，MgSO4·7H2O?0.2g，CaSO4·2H2O?0.1g，CaCO3?5g，蒸餾水1000mL，pH?7.0)平板上，在28℃培養(yǎng)2-3d至長出單菌落。用接種針挑取不同單菌落，在Ashby平板上劃線純化3次得到單一菌落。將純化后的單菌落接種于LB培養(yǎng)基(成分為胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH?7.0)平板上，4℃存放，供近期使用；純化的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期，將菌液與終濃度為15％甘油混合，-80℃冰箱長期保存。實(shí)施例2??本專利技術(shù)菌株的固氮酶活性?采用乙炔還原乙烯法(acetylene?reduction?assay，ARA)測定固氮酶活性。將GG08160活化后在Ashby液體培養(yǎng)基中生長48h，取1mL菌液接種于滅菌的含10mL?Ashby液體培養(yǎng)基的60mL磨口小口瓶中，培養(yǎng)24h后從瓶內(nèi)抽出5mL氣體，然后再注入5mL乙炔氣體，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用氣相色譜儀檢測乙烯生成量，以nmolC2H4/h.mL表示固氮酶活性。以巴西甘蔗內(nèi)生固氮菌G.diazotrophicus?PAL5為陽性對照，以接種1mL滅活菌液的處理作為空白對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本專利技術(shù)菌株的固氮酶的乙炔還原乙烯活性為1632nmol?C2H4/h，與陽性對照巴西甘蔗內(nèi)生固氮菌模式菌株G.diazotrophicus?PAL5的固氮酶活性1675nmol?C2H4/h相當(dāng)。?實(shí)施例3??本專利技術(shù)菌株的nifH基因及16S?rDNA的克隆分析?PCR擴(kuò)增模板的制備：將菌株GG08160活化后接種到LB液體培養(yǎng)基(成分為胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000mL，pH?7.0)，培養(yǎng)20h后離心收集菌體備用。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按產(chǎn)品說明書從新鮮的細(xì)菌LB培養(yǎng)物中提取本專利技術(shù)菌株的基因組DNA，保存于-20℃，DNA含量約為50-100ng/μL。nifH基因分析：擴(kuò)增引物為PolyF(TGCGAYCCSAARGCBGACTC)和PolyR?(ATSGCCATCATYTCRCCGGA)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃?3min預(yù)變性，然后進(jìn)本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株對草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌，其特征在于：菌株命名為GG08160，具有高抗草甘膦的活性，能與甘蔗聯(lián)合固氮并顯著促進(jìn)甘蔗幼苗的生長。

【技術(shù)特征摘要】
1.一株對草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌，其特征在于：菌株命名為GG08160...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：胡春錦，李楊瑞，史國英，林麗，魏源文，鄧智年，李楠，
申請(專利權(quán))人：廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：