層析方法及為此使用的介質技術

本發明專利技術涉及在介質上進行離子交換層析的方法，所述介質包含具有多孔內芯和外殼的殼式珠粒，其中內芯提供有其電荷隨pH改變的配位體，殼提供有帶電荷的離子交換配位體，所述方法包括以下步驟：a)使樣品分子在第一pH吸附在殼配位體上；b)通過加入緩沖劑物質使內芯配位體在第二pH放電，所述緩沖劑物質能夠增加它與芯配位體相同符號/類型的電荷，這同時導致離子從內芯配位體釋放，從而導致增加離子強度，增加離子強度從殼配位體置換樣品分子，即，產生洗脫。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】專利
本專利技術涉及新的離子交換介質及其用途。更準確地講，本專利技術涉及在包含殼式珠粒(shell?bead)的介質上進行離子交換層析的方法。介質包含在芯中其電荷隨pH改變的配位體和在外殼中能夠結合樣品分子的離子交換配位體。背景在生物技術內，最近提出的層析方法基于與靶相互作用的不同模式。因此，例如，在離子交換層析中，官能團為與它們的相反電荷可交換反離子的持久結合的離子基團。生物分子的離子交換層析一般使用的層析介質用在珠粒中均勻分布的適合帶電配位體取代。為了達到用于洗脫被吸附生物分子的鹽梯度和/或pH梯度，用具有不同洗脫劑的兩個泵得到梯度。最初，非排代流動相泵輸送大部分(如果不是全部)流量通過層析介質，而排代流動相泵將很少(或甚至沒有)流量輸送通過層析介質。然后，連續或間歇改變各泵的流速，以得到適合洗脫被吸附化合物的梯度。因此，在很多情況下，為了洗脫被吸附的樣品分子，希望比使用常規雙泵裝配用來產生鹽梯度和/或pH梯度更簡單的進行離子交換層析的方法。專利技術概述本專利技術提供進行離子交換層析的新原理，所述原理不依賴雙泵裝配來產生鹽梯度和/或pH梯度用于洗脫被吸附的樣品分子。第一方面，本專利技術提供在介質上進行離子交換層析的方法，所述介質包含具有多孔內芯和外殼的殼式珠粒，其中內芯提供有其電荷隨pH改變的配位體，殼提供有帶電荷的離子交換配位體，所述方法包括以下步驟：a)使樣品分子在第一pH吸附在殼配位體上；b)通過加入緩沖劑物質使內芯配位體在第二pH放電，所述緩沖劑物質能夠增加它與芯配位體相同符號/類型的電荷，這同時導致離子從內芯配位體釋放，從而導致增加離子強度，增加離子強度從殼配位體置換樣品分子，即，產生洗脫。可使用任何類型的緩沖劑物質，例如，胺緩沖劑，只要它與芯配位體(例如，胺配位體)為相同類型(具有相同類型的電荷)。根據以下公式，在pH增加時，這引起增加的離子強度：?M=珠粒基質。優選外殼配位體為強離子交換配位體，例如-+N(CH3)3和所有類型的季銨配位體，非芳族和芳族-SO3–配位體。在優選的實施方案中，官能化芯的電荷改變/pH單位為>30μmol/pHmL凝膠。根據本專利技術的方法，殼配位體和芯配位體可具有相同或不同的電荷，并且選自任何類型的陽離子配位體，例如羧酸根(-COO-)、膦酸根或磷酸根(分別為-PO32-、-P(OH)O2-和-OP(OH)O2-、-OPO32-)、磺酸根或硫酸根(分別為-SO3-和-OSO3-)、-芳基-O-(酚根/芳醇根(arylolate))；或任何類型的陰離子配位體，例如，帶正電荷的不同的氮，例如，伯銨、仲銨、叔銨、季銨和脒鎓(amidinium)。根據前述主張中一項或多項的方法，其中芯的孔隙率防止或允許樣品分子穿透進入芯。優選殼式珠粒具有3至400μm的直徑，外殼為0.5-100μm厚。例如，在具有100μm直徑的殼式珠粒的情況下，外殼為0.5-10μm。在具有300μm直徑的殼式珠粒的情況下，外殼為0.5-30μm。在供選的實施方案中，在方法以柱形式進行時，流的方向在洗脫步驟中反向，即，將柱倒轉。這使得能夠有足夠時間用于離子強度積累，并實現樣品分子通過層析床的較短輸送距離，從而得到尖峰。第二方面，本專利技術涉及用于以上方法的層析介質，所述介質包含具有多孔內芯和外殼的殼式珠粒，其中內芯提供有其電荷隨pH改變的配位體，殼提供有帶電荷的離子交換配位體。第三方面，本專利技術涉及以上層析介質用于生物和合成源的樣品分子的離子交換層析的用途，所述樣品分子例如細胞和/或其部分、病毒和/或其部分、蛋白、復合蛋白、融合蛋白、肽、核酸、兩性大分子、兩性顆粒、藥物、藥物片段。該用途可為柱、微量滴定(microtiter)或批形式。附圖簡述圖1顯示用于陽離子交換介質的珠粒設計，具有芯配位體，芯配位體的電荷和結合相關反離子的能力可由pH轉變來改變。圖2顯示在用50%的原型HFA?55芯?PEI殼-S(弱陰離子配位體)和50%?的S-殼(強陽離子)原型填充的柱上的核糖核酸酶A的分離(細節參見實驗部分)。專利技術詳述本專利技術提出使用具有芯的“殼式珠粒”，芯用可質子化和可去質子化的官能團(弱離子交換配位體)官能化，芯可通過用(緩沖劑)化合物改變pH來減少電荷或放電，(緩沖劑)化合物繼而在過程中增加芯的電荷，同時改變周圍溶液(流動相)中的離子強度，并實現吸附到帶電優選強離子交換配位體的蛋白的洗脫。目標為樣品吸附的離子交換配位體優選連接到薄外殼，芯配位體為具有允許在對應用適合的pH范圍中改變電荷的pKa的弱離子交換配位體，芯配位體可以為帶有與殼配位體相同的電荷或相反的電荷兩者。為了通過在短pH間隔中相對尖pH轉變來改變電荷或者在寬pH間隔中緩慢地逐漸改變電荷，芯配位體可取決于它們所選擇的化學結構。可用后者類型的配位體在層析柱上產生pH和鹽梯度。與共同待決SE專利申請1050157-5的色譜聚焦介質比較，為了釋放足夠高量的鹽離子，在本專利技術的芯中的配位體密度高數倍。為了避免結合樣品取代基，可調節芯的孔隙率，以排除蛋白/肽。另外，流動相可使用“一般”緩沖物質的簡單混合物，所述緩沖物質能夠使芯配位體放電和同時獲得具有相同符號的電荷，因此允許從芯配位體釋放反離子。當然，只有一個泵(沒有洗脫劑混合設備)是在珠粒中和周圍得到增加的離子強度所必需的。此類型介質的主要應用領域是蛋白和肽的大規模精制。此類型珠粒也非常適用于分析應用。現在將結合附圖和實驗部分描述本專利技術。實驗部分在本文中實施例只為了說明目的提出，不應解釋為限制附加權利要求限定的專利技術。總論基質的體積是指澄清床體積，以克給出的基質的重量是指抽干重量(去除空隙水的溶脹珠粒)。為了反應，攪拌使用電動攪拌器。將常規方法用于分析官能性和確定烯丙基化度或珠粒上的胺含量度。以下說明制備本專利技術的分離基質的一種方法，從交聯瓊脂糖凝膠(Sepharose??HFA?55，GE?Healthcare，Uppsala，Sweden)開始。Sepharose?HFA?55的珠粒直徑為約90μm。采用基于Sepharose?HFA?55?-?HFA?55芯-PEI殼-SO3-的內部pH和離子強度梯度洗脫的等度離子交換層析所用殼介質的制備Sepharose?HFA?55的烯丙基活化在玻璃過濾器上用蒸餾水洗滌Sepharose?HFA?55。將凝膠(800mL排水凝膠)加入3頸圓底燒瓶。加入NaOH(800mL，50%溶液)，并開始機械攪拌，將漿料在水浴上加熱到50℃。在約1小時后，加入168mL烯丙基縮水甘油基醚(AGE)。然后使漿料在劇烈攪拌下過夜。在約20小時后，將漿料轉移到玻璃過濾器，用蒸餾水(x5)、乙醇(x2)和蒸餾水(x5)洗滌。然后通過滴定(230μmol/mL)測定烯丙基含量。殼活化(部分溴化)將100mL烯丙基化凝膠稱入燒瓶，并加入1000mL蒸餾水。使0.354mL溴溶于100mL蒸餾水，將此溶液加到烯丙基化凝膠漿料。該量的溴相當本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.07.09 SE 1050774-71.?一種在介質上進行離子交換層析的方法，所述介質包含具有多孔內芯和外殼的殼式珠粒，其中內芯提供有其電荷隨pH改變的配位體，殼提供有帶電荷的離子交換配位體，所述方法包括以下步驟：a)使樣品分子在第一pH吸附在殼配位體上；b)通過加入緩沖劑物質使內芯配位體在第二pH放電，所述緩沖劑物質能夠增加它與芯配位體相同符號/類型的電荷，這同時導致離子從內芯配位體釋放，從而導致增加離子強度，增加離子強度從殼配位體置換樣品分子，即，產生洗脫。
2.?權利要求1的方法，其中殼配位體為強離子交換配位體，例如-+N(CH3)3和所有類型的季銨配位體、非芳族和芳族-SO3–配位體。
3.?權利要求1至2的方法，其中官能化芯的電荷改變/pH單位為>30μmol/pHmL凝膠。
4.?前述權利要求中一項或多項的方法，其中殼配位體和芯配位體可具有相同或不同的電荷，并且選自任何類型的陽離子配位體，例如羧酸根(-COO-)、膦酸根或磷酸根(分別為-PO32-、-P(OH)O2-和-OP(OH)O2-、-OPO32-)、磺酸根或硫酸根(...

【專利技術屬性】
技術研發人員：J貝格斯特倫，BL約翰遜，
申請(專利權)人：通用電氣健康護理生物科學股份公司，
類型：
國別省市：