超載和洗脫層析制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了通過超載層析材料和洗脫產(chǎn)物，從包含多肽和至少一種污染物的組合物中純化多肽的方法。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】超載和洗脫層析相關(guān)申請本申請要求于2011年11月2日提交的臨時專利申請U.S.系列號61/554,898的優(yōu)先權(quán)益，其通過引用全文整合到本文中。專利
本專利技術(shù)提供了從包含產(chǎn)物和至少一種污染物的組合物中純化產(chǎn)物的方法，和包含通過所述方法純化的產(chǎn)物的制劑。專利技術(shù)背景陰離子交換(AEX)層析被普遍用于流通模式中作為單克隆抗體(MAb)的平臺精制步驟。在標(biāo)準(zhǔn)的流通條件下結(jié)合AEX樹脂的某些Mab可以解決設(shè)備的適應(yīng)性難題。對于質(zhì)量要求通常較低的早期臨床研發(fā)階段，通過使用結(jié)合和洗脫模式的AEX或混合模式的樹脂純化這些非平臺性的Mab。然而，由于這些樹脂的低動態(tài)結(jié)合容量(DBC)，晚期執(zhí)行時將需要大小約1000L的柱子，或者在較小柱子上進(jìn)行多次循環(huán)，因而限制了設(shè)備的通量。通常使用結(jié)合和洗脫層析(B/E)或流通(F/T)層析實施MAb純化。目前，已經(jīng)將弱分配層析(Kelley,BD等，2008BiotechnolBioeng101(3):553-566；美國專利申請公開號2007/0060741)和過載層析(PCT/US2011/037977)分別導(dǎo)入到AEX樹脂和陽離子交換(CEX)樹脂上，以增強MAb純化。下文強調(diào)了這些層析模式每者的一般機制和限制。結(jié)合和洗脫層析：在B/E層析中，通常裝載產(chǎn)物使層析材料的DBC最大化，然后鑒別洗滌和洗脫條件，使得洗脫液中獲得最大產(chǎn)物純度。B/E層析的限制是裝載密度與實際樹脂DBC的限制。流通層析：使用F/T層析，鑒別了這樣的裝載條件，在所述條件下雜質(zhì)與層析材料強結(jié)合，同時產(chǎn)物流通。F/T層析允許對標(biāo)準(zhǔn)MAb進(jìn)行高裝載密度，但對非平臺性MAb卻不能執(zhí)行，或者能夠?qū)δ切┓瞧脚_性MAb進(jìn)行F/T操作的溶液條件不能在現(xiàn)有的生產(chǎn)設(shè)備中執(zhí)行。弱分配層析：該操作模式通過鑒別溶液條件，增強了F/T模式，在所述溶液條件下具有MAb與樹脂的弱結(jié)合(2至20g/L)。在這些條件下，雜質(zhì)比在F/T模式下的結(jié)合更強，因而獲得了增強的純化。然而，裝載條件靶向具有范圍在0.1-20內(nèi)的低產(chǎn)物分配系數(shù)(Kp)。過載層析：在該層析模式下，超過層析材料對產(chǎn)物的動態(tài)結(jié)合容量裝載目標(biāo)產(chǎn)物，因而被稱為過載。所述操作模式已被證實用陽離子交換(CEX)基質(zhì)，特別是用膜提供了MAb純化。然而，該方法的限制是樹脂的低產(chǎn)量，因為沒有洗脫階段。將多肽大規(guī)模的、有成本效益地純化至足以用作人治療劑的純度仍然是艱巨的難題。本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請和公開都通過引用全文整合到本文中。概述本專利技術(shù)提供了用于從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽的方法，所述方法包括a)以超過層析材料對于多肽的動態(tài)結(jié)合容量的量將組合物裝載到層析材料上，b)在其中一種或多種污染物仍然與層析材料結(jié)合的條件下，從層析材料上洗脫多肽，和c)混合包含步驟a)和b)的層析流出液中的多肽的級分。在一些實施方案中，多肽是抗體或免疫粘附素。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體；例如但不限于嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在一些實施方案中，抗體是抗原結(jié)合片段；例如但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、di-scFv、bi-scFv、串聯(lián)(di,tri)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗體、BiTE、雙抗體和三價抗體。在一些實施方案中，多肽是酶、激素、融合蛋白、含有Fc的蛋白質(zhì)、免疫綴合物、細(xì)胞因子或白介素。在一些實施方案中，多肽是從包含一種或多種污染物的組合物中純化的；例如，中華倉鼠卵巢蛋白(CHOP)、宿主細(xì)胞蛋白(HCP)、泄露的蛋白A、羧肽酶B、核酸、DNA、產(chǎn)物變體、聚集的蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基組分、慶大霉素、多肽片段、內(nèi)毒素和病毒性污染物。在本專利技術(shù)的一些實施方案中，層析材料選自混合模式材料、陰離子交換材料、疏水性相互作用材料，和親和材料。在一些實施方案中，以約層析材料對于一種或多種污染物的動態(tài)結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。在一些實施方案中，多肽的層析材料的分配系數(shù)大于30或大于100。在一些實施方案中，方法提供了這樣的OEC，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。在其他實施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。在一些實施方案中，方法提供了這樣的OEC，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的pH的pH。在其他實施方案中，洗脫緩沖液具有大于裝載緩沖液的pH的pH。在一些實施方案中，方法的多肽在來自親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和疏水性相互作用層析的洗出液中。在一些實施方案中，多肽在來自蛋白A層析的洗出液中。在一些實施方案中，還通過例如病毒過濾、親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析和/或疏水性相互作用層析進(jìn)一步純化方法的多肽。在一些實施方案中，多肽是通過例如超濾、滲濾或超濾和滲濾的組合而進(jìn)一步濃縮的。在一些實施方案中，方法的多肽還與可藥用的運載體組合。附圖簡述圖1顯示了在MAb3的分批結(jié)合條件下，在CaptoAdhere樹脂上的高通量篩選(HTS)結(jié)果。圖1A顯示了MAb3的Kp常數(shù)值的等值線。圖1B顯示了在用樹脂嘗試80g/L產(chǎn)物的上清液時，MAb3的實際結(jié)合容量。圖1C顯示了在用樹脂嘗試80g/L產(chǎn)物的上清液時，雜質(zhì)(宿主細(xì)胞蛋白)的實際結(jié)合容量。所有的等值線圖都是使用源自原始數(shù)據(jù)的應(yīng)答表面模型生成的。圖2顯示了優(yōu)化的OEC操作模式的層析圖。用于該次運行的MAb3的裝載密度為180g/L。圖3顯示了使用MAb3的OEC模式的裝載優(yōu)化。圖4顯示了具有OEC操作模式的靶裝載條件的層析圖。相似的裝載和洗脫條件導(dǎo)致拖尾，因而導(dǎo)致混合物體積增加了45％。用于該次運行的MAb3的裝載密度為180g/L。圖5顯示了使用MAb3的OEC模式的洗脫優(yōu)化。圖6顯示了級分中的雜質(zhì)分析和雜質(zhì)的累積分析。圖7顯示了在1000g/L裝載密度的OEC模式下，CaptoAdhere樹脂的MAb3CHOP貫穿(breakthrough)分析。圖8顯示了在從70g/L至180g/L的裝載密度范圍內(nèi)試驗性規(guī)模運行的產(chǎn)率分析。圖9顯示了對弱分配層析操作模式和過載和洗脫層析操作模式的比較。產(chǎn)物是MAb3，層析材料是CaptoAdhere樹脂。圖10顯示了在150g/L裝載密度的OEC操作模式下，QMA樹脂的MAb3CHOP分析。圖11顯示了在150g/L裝載密度的OEC操作模式下，CaptoAdhere樹脂的MAb4CHOP分析。圖12顯示了在150g/L裝載密度的OEC操作模式下，CaptoMMC樹脂的MAb4CHOP分析。圖13顯示了在200g/L裝載密度的OEC模式下，CaptoAdhere樹脂的MAb3CHOP貫穿分析。將MAb3蛋白A混合物裝載到CaptoAdhere樹脂上，至200g/L(超過產(chǎn)物結(jié)合容量50g/L)。CHOP貫穿分析顯示多至200g/LMAb處理CHOP未貫穿。專利技術(shù)詳述I.定義如本文描述的術(shù)語“產(chǎn)物”是待通過OEC純化的物質(zhì)；例如，多肽。術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”在本文中可互換的使用，指任何長度的氨基酸聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，并可以被非氨基酸中斷。術(shù)語還涵蓋了被天然地或通過介入修飾的氨基酸聚合物；例如，形成二硫鍵、糖基化、脂化、乙酰本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點】
用于從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽的方法，所述方法包括a)以超過層析材料對于多肽的動態(tài)結(jié)合容量的量將組合物裝載到層析材料上，b)在一種或多種污染物仍然與層析材料結(jié)合的條件下，從層析材料上洗脫多肽，和c)混合包含步驟a)和b)的層析流出液中的多肽的級分。

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2011.11.02 US 61/554,8981.用于從包含抗體和一種或多種污染物的組合物中純化抗體的方法，所述方法包括a)以超過層析材料對于抗體的動態(tài)結(jié)合容量的量將組合物裝載到層析材料上，b)在一種或多種污染物仍然與層析材料結(jié)合的條件下，從層析材料上洗脫抗體，和c)混合包含步驟a)和b)的層析流出液中的抗體的級分，其中組合物的裝載密度在200g/L至1000g/L之間并且其中方法還包括使用裝載緩沖液和洗脫緩沖液，其中洗脫緩沖液具有小于裝載緩沖液的電導(dǎo)率的電導(dǎo)率。2.權(quán)利要求1的方法，其中抗體是單克隆抗體。3.權(quán)利要求2的方法，其中單克隆抗體是嵌合抗體、人源化抗體，或人抗體。4.權(quán)利要求2的方法，其中單克隆抗體是IgG單克隆抗體。5.權(quán)利要求1的方法，其中抗體是抗原結(jié)合片段。6.權(quán)利要求5的方法，其中抗原結(jié)合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、di-scFv、bi-scFv、串聯(lián)(di,tri)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗體、BiTE、雙抗體或三價抗體。7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中至少一種污染物是中華倉鼠卵巢蛋白(CHOP)、宿主細(xì)胞蛋白(HCP)、泄露的蛋白A、羧肽酶B、核酸、DNA、產(chǎn)物變體、聚集的蛋白質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基組分、慶大霉素、多肽片段、內(nèi)毒素和病毒性污染物中的任何一種或多種。8.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中層析材料是混合模式材料、陰離子交換材料、疏水性相互作用材料，或親和材料。9.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中以層析材料對于一種或多種污染物的動態(tài)結(jié)合容量將組合物裝載到層析材料上。10.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中以層析材料對于抗體的動態(tài)結(jié)合容量的20倍將組合物裝載到層析材料上。11.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中層析材料對抗體的分配系數(shù)大于30。12.權(quán)利要求11的方法，其中層析材料對抗體的分配系數(shù)大于100。13.權(quán)利要求1的方法，其中裝載緩沖液具有4.0mS/cm至7...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：D·納達(dá)拉賈，A·梅塔，
申請(專利權(quán))人：弗·哈夫曼拉羅切有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：瑞士;CH