本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種陽離子交換層析柱的清洗方法，所述方法包括如下步驟：（1）將使用過的陽離子交換層析柱，用水清洗，再用NaOH溶液（2）最后用平衡緩沖液(pH5.0-8)沖柱子，接收清洗液。本發(fā)明專利技術(shù)還包括步驟（3）和（4）的驗證步驟，具體如下：（3）取清洗液，滴磷酸，觀察有無沉淀產(chǎn)生，如無沉淀，用總有機碳分析儀測定清洗液，測定結(jié)果低于500ppm，則表示清洗合格。（4）若有沉淀產(chǎn)生，須用水將步驟2得到清洗液稀釋直至滴加磷酸后無沉淀出現(xiàn)后，將稀釋后的清洗液用總有機碳分析儀測定該清洗液，測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)獲得的數(shù)據(jù)低于500ppm，則表示清洗合格。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及層析柱的清洗方法，特別涉及。
技術(shù)介紹
在生物制藥領(lǐng)域，陽離子交換層析柱被廣泛應(yīng)用。在陽離子交換層析柱使用后，填 料中會有一些殘留物質(zhì)，可能會對下次使用造成污染，引入外來污染物，比如會對下一次使 用引入內(nèi)毒素或者將上一次沒有清洗干凈的蛋白引入到下次產(chǎn)物中。 現(xiàn)有清洗方法主要用水浸泡沖洗，或用緩沖溶液，酸，堿等溶液進行浸泡沖洗，但 因沒有適當(dāng)?shù)臋z測方法對清洗過的填料進行檢測，對清洗效果無法保障。為保證每次使用 后的陽離子交換層析柱清洗干凈，不會對下一次使用造成污染，需要建立規(guī)范的陽離子交 換層析柱的清洗流程。 本專利技術(shù)經(jīng)過研究，找到一種簡單易行，適合工業(yè)化的清洗方法，即通過三步清洗 法，可以保證內(nèi)毒素和總有機碳清洗合格。本專利技術(shù)通過固定并優(yōu)化的清洗方法對陽離子交 換層析柱進行清洗，使得陽離子交換層析柱清洗效果得到了保障，去除了陽離子交換層析 內(nèi)的內(nèi)毒素，微生物以及上一次使用殘留的蛋白，確保了總有機碳檢驗合格。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供了，所述清洗是指對使用過或?qū)⒁?使用的不潔填料進行清洗，清洗合格后進行下一次的柱層析。 本專利技術(shù)所述陽離子交換層析柱，其填料為任何一種具有陽離子交換層析功能的填 料，優(yōu)選：SPSepharoseFastFlow，SSepharoseFastFlow最優(yōu)選的為SPSepharose FastFlow。 上述填料均可以通過現(xiàn)有技術(shù)制備，也可通過購買得到。 本專利技術(shù)提供，包括如下步驟：步驟1， 將不潔的陽離子交換層析柱填料，用水清洗，再用NaOH水溶液清洗； 步驟 2， 用平衡緩沖液（pH5. 0-8)清洗。 根據(jù)需要，本專利技術(shù)還包括步驟3和步驟4的步驟，如下：步驟 3， 取步驟2得到的清洗液，滴磷酸，觀察有無沉淀產(chǎn)生，如無沉淀，用總有機碳分析 儀測定該清洗液，測定結(jié)果低于500ppm，則表示清洗合格。步驟 4， 若有沉淀產(chǎn)生，須用水將清洗液稀釋直至滴加磷酸后無沉淀出現(xiàn)后，將稀釋后的 清洗液用總有機碳分析儀測定該清洗液，測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)獲得的數(shù)據(jù)低于500ppm， 則表示清洗合格 本專利技術(shù)所述的陽離子交換層析柱，優(yōu)選填料為SPSepharoseFastFlow;柱型號： BPG100、BPG500、XK2、XK20、XK50、XK20 中一種，優(yōu)選BPG100。所述的柱子徑高比：（0? 5-1): 1，優(yōu)選（0. 5-0. 7) :1。最優(yōu)選柱子高15cm以內(nèi)，直徑：10cm。 本專利技術(shù)的清洗方法，可以將填料從層析柱上取下后在容器中清洗，也可裝在層析 柱中清洗，優(yōu)選裝在層析柱中清洗，其中清洗液流速為120-150ml/min，優(yōu)選120ml/min。 本專利技術(shù)步驟（1)中所述的水優(yōu)選為注射用水，清洗時間為30_45min。 所述的氫氧化鈉水溶液優(yōu)選1-1. 5M的氫氧化鈉水溶液，清洗時間90min以上，最 佳為I.OM氫氧化鈉清洗90-100min。 所述的IM氫氧化鈉配制方法：稱取氫氧化鈉400. 0g，用注射用水將其移入血清瓶 或儲液袋中，放入攪拌子，移至磁力攪拌器上使固體全部溶解均勻，將血清瓶或儲液袋內(nèi)溶 液標(biāo)定到10L，繼續(xù)攪拌2分鐘。配制后放置于2~12°C環(huán)境的準(zhǔn)備間指定區(qū)域內(nèi)備用。 本專利技術(shù)步驟（2)中所述的平衡緩沖液優(yōu)選為磷酸緩沖液并含NaCl，優(yōu)選0.Olmol/ L磷酸緩沖液（pH6. 0含0. 1-0. 2MNaCl)，最佳為0.Olmol/L磷酸緩沖液（pH6. 0含0.IM NaCD0 優(yōu)選所述的0?Olmol/L平衡緩沖液（pH6. 0±0. 1含0?lmol/LNaCl)的配制：稱 取氯化鈉58. 9g，磷酸二氫鈉12. 0g，磷酸氫二鈉2. 0g，用注射用水將其移入血清瓶或儲液 袋中，放入攪拌子，移至磁力攪拌器上使固體全部溶解均勻，將血清瓶或儲液袋內(nèi)溶液標(biāo)定 到10L，繼續(xù)攪拌2分鐘，確定其pH值在6.0±0. 1范圍內(nèi)。配制后放置于2~12°C環(huán)境的 準(zhǔn)備間指定區(qū)域內(nèi)備用。 本專利技術(shù)步驟（3)中所述的滴磷酸，是將清洗液加到容器中，加入濃度的磷酸，靜置， 肉眼觀察有無沉淀析出。其目的是初步確認(rèn)清洗液中含碳量，如果出現(xiàn)沉淀說明含碳量較 高，可能在檢驗過程中會堵塞總有機碳分析儀管路。 所述用總有機碳分析儀測定，是用總有機碳分析儀清洗液中的總有機碳濃度。本 專利技術(shù)步驟（4)中所述的須用水稀釋清洗液，方法如下：若有沉淀產(chǎn)生，須用水將清洗液稀釋 直至滴加磷酸后無沉淀出現(xiàn)后，將稀釋后的清洗液用總有機碳分析儀測定該清洗液，測定 結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)獲得的數(shù)據(jù)低于500ppm，則表示清洗合格。 本專利技術(shù)相關(guān)術(shù)語的解釋： 1、陽離子交換層析：是蛋白分離的一種技術(shù)，主要依賴電荷間的相互作用，利用帶 電分子中電荷微小差異進行蛋白質(zhì)分離。 2、內(nèi)毒素：是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對宿主是 有毒性的。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來。 3、總有機碳（T0C):是指水體中溶解性和懸浮性有機物含碳的總量。TOC是一個快 速檢定的綜合指標(biāo)，它以碳的數(shù)量表示水中含有機物的總量，單位為ppm或ppb。在國際上 TOC被作為評價水體中有機物污染程度的一項重要參考指標(biāo)。 本專利技術(shù)的陽離子交換層析柱的清洗方法，是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下： 1、清洗液濃度的選擇下表1清洗液按照實施例的順序沖洗，結(jié)果如下：表1 從上表2可見，清洗液用時間100與110效果相同，出于節(jié)省原則，優(yōu)選清洗液時 間為 90-100min。 以下通過比較實驗證明本專利技術(shù)的有益效果： 現(xiàn)有技術(shù)沖柱子方法與本專利技術(shù)的方法進行比較表 3 現(xiàn)有技術(shù)沖柱子方法1: 將使用過的陽離子交換層析柱首先用注射用水清洗30min，然后用IMNaOH清洗 60min，最后用 0?Olmol/L平衡緩沖液（pH6. 0±0. 1 含 0?lmol/LNaCl)沖柱子 90min，清洗 時液體流速為：120ml/min;取柱子流出液進行內(nèi)毒素及TOC檢測，結(jié)果不符合要求。 現(xiàn)有技術(shù)方法2: 將使用過的陽離子交換層析柱首先用注射用水清洗30min，然后用0. 5MNaOH清 洗 90min，最后用 0.Olmol/L平衡緩沖液（pH6. 0±0. 1 含 0.lmol/LNaCl)沖柱子 90min， 清洗時液體流速為：120ml/min;取柱子流出液進行內(nèi)毒素及TOC檢測，結(jié)果不符合要求。 試驗例2 對本專利技術(shù)實施例1的方法進行了多次實證實驗，證明在本專利技術(shù)的條件下，用實施 例1的方法，內(nèi)毒素含量，總有機碳含量，微生物含量，合格率可以達(dá)到99%。實驗如下： 陰離子交換層析柱使用完畢開始清洗 清洗時液體流速為：120ml/min 用注射用水清洗3900ml 用 0? 5MNaOH含IMNaCl清洗 3900 ~4200ml 用注射用水清洗3900ml 用30%異丙醇清洗3900ml 用 25% 乙酸清洗 3900ml 用注射用水清洗3900~4200ml 用 0? 5MNaOH含IMNaCl清洗 3900 ~4200ml 然后用磷酸緩沖液（0?OlMPBS(pH6. 0 含 0? 1 ~0? 2MNaCl))沖柱子 13000ml; 清洗結(jié)束后，將層析柱保存于2~12°C的層析柜內(nèi) 其本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種陽離子交換層析柱的清洗方法，其特征在于，包括如下步驟：?步驟1，?將不潔的陽離子交換層析柱填料，用水清洗，再用NaOH溶液清洗；?步驟2，?用pH5?8的平衡緩沖液清洗，所述的平衡緩沖液為磷酸緩沖液并含NaCl。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李雪峰，趙國焓，邵海玲，
申請(專利權(quán))人：上海天士力藥業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31
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