一種蝦原肌球蛋白的純化方法技術

本發明專利技術公開了一種蝦原肌球蛋白的純化方法，而提供一種純度高，有利于大規模生產的純化方法。將蝦原肌球蛋白粗品溶于pH值為3.2-3.6的平衡緩沖液中得到樣品液，加入到陰離子層析柱中，用pH值為3.2-3.6的平衡緩沖液洗脫，收集穿柱峰所對應的溶液；調節穿柱峰所對應的溶液的pH值為5.8-6.0，加入到陽離子層析柱中，用pH值為5.8-6.0的平衡緩沖液洗脫，收集穿柱峰所對應的溶液，透析除鹽、干燥，獲得高純度的蝦原肌球蛋白。本發明專利技術的純化方法通過陰離子交換層析和陽離子交換層析的結合，使得目的蛋白存在于穿柱峰中，能夠很好的保持蛋白的活性，獲得的蛋白純度高，通過兩步離子交換層析法，處理量大，操作簡單，有利于大規模生產。

【技術實現步驟摘要】
【專利摘要】本專利技術公開了，而提供一種純度高，有利于大規模生產的純化方法。將蝦原肌球蛋白粗品溶于pH值為3.2-3.6的平衡緩沖液中得到樣品液，加入到陰離子層析柱中，用pH值為3.2-3.6的平衡緩沖液洗脫，收集穿柱峰所對應的溶液；調節穿柱峰所對應的溶液的pH值為5.8-6.0，加入到陽離子層析柱中，用pH值為5.8-6.0的平衡緩沖液洗脫，收集穿柱峰所對應的溶液，透析除鹽、干燥，獲得高純度的蝦原肌球蛋白。本專利技術的純化方法通過陰離子交換層析和陽離子交換層析的結合，使得目的蛋白存在于穿柱峰中，能夠很好的保持蛋白的活性，獲得的蛋白純度高，通過兩步離子交換層析法，處理量大，操作簡單，有利于大規模生產。【專利說明】
本專利技術涉及蛋白提取
，具體的說，是涉及。
技術介紹
全世界有30% -40%的人受到食品過敏問題的困擾，其中由蝦與蟹等甲殼類動物及其制品所引起的過敏尤為突出。而這些動物機體肌肉組織中的原肌球蛋白(Tropomyosin, TM)是最主要也是致敏性最強的過敏原蛋白。制備具有較高純度的TM蛋白制品對于研究該蛋白的結構與致敏性，以及如何消減其過敏原性具有十分重要的意義。同時。高純度TM蛋白對于過敏原的檢驗檢測以及作為標準蛋白，也具有十分重要的應用價值。 目前從蝦中分離純化TM蛋白的工藝一般分為三個階段: 第一階段是制備蝦纖維蛋白干粉，具體過程為:將對蝦洗凈，除去蝦殼和蝦肉表面的膜，然后將機體組織特別是肌肉組織置于一定體積的且具有一定離子強度的緩沖液(pH?7.0)中，室溫下勻漿，離心后收集沉淀，此時可以除去大部分的肌漿蛋白。所收集的沉淀中加入預冷的有機溶劑，如乙醇，乙醚或丙酮等，反復抽提并離心，利用有機溶劑除去沉淀中的脂質成分，脫脂后的沉淀再經自然風干就可得到纖維蛋白干粉。 第二階段是KC1溶液浸提再結合硫酸銨鹽析沉淀提取蝦纖維蛋白粉中的TM蛋白，具體步驟為:將所獲得的纖維蛋白干粉復溶于含有lmol/L KC1的中性緩沖液中，利用TM蛋白的鹽溶性，獲取原肌球蛋白粗提液，在提取過程中加入一些保護劑，如二硫蘇糖醇、β -巰基乙醇等，防止晶體蛋白高分子形成聚合物，使蛋白質保持原有的構象，同時，加入低濃度的氯化鈣可穩定原肌球蛋白結構保持其天然構象。然后加入一定量的(NH4)2S04*NaCl等中性鹽，混勻后靜置一段時間再離心透析、凍干等步驟，獲得一定純度的TM蛋白粗品。 第三階段通常是利用層析技術進行TM蛋白的純化，如分子篩層析、離子交換層析、HPLC等技術，最終獲得純度較高的TM蛋白制品。 目前用于制備TM蛋白粗品的方法較為成熟，人們都是利用前面所述的方法來制備蝦纖維蛋白粉以及鹽溶液浸提，鹽析沉淀分離得到有一定純度的TM蛋白粗品。但是其純化工藝仍然存在一定問題: 1、從動物機體提取分離得到的TM蛋白純度不高，利用目前已有的純化工藝路線，無論是分子篩、離子交換層析或HPLC所得樣品的純度均小于95% ； 2、現有的純化工藝中，HPLC純化技術所用的儀器昂貴、耗材貴(無論是純化柱材料還是洗脫溶劑)、制備規模小且樣品不易回收；離子交換層析法的目的蛋白存在于洗脫峰中，所得樣品的純度也不高，需要再接一次分子篩層析法才能夠將純提高到90 %以上，但是這種純化工藝的處理量不高，分子篩的顯著缺點就是其純化工藝雖簡單，由于處理量太小，不利于規模化處理純化樣品。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，而提供一種純度高，有利于大規模生產的蝦原肌球蛋白的純化方法。 為實現本專利技術的目的所采用的技術方案是: ，包括下述步驟: (1)將蝦原肌球蛋白粗品溶于pH值為3.2-3.6的平衡緩沖液中得到樣品液，將所得樣品液加入到陰離子層析柱中，再用pH值為3.2-3.6的所述平衡緩沖液洗脫，收集穿柱峰所對應的溶液； (2)調節步驟(1)收集到的穿柱峰所對應的溶液的pH值為5.8-6.0，然后加入到陽離子層析柱中，再用pH值為5.8-6.0的所述平衡緩沖液洗脫，收集穿柱峰所對應的溶液，于4°C下透析除鹽、干燥，獲得高純度的蝦原肌球蛋白。 所述平衡緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉平衡緩沖液或醋酸-醋酸鈉平衡緩沖液。 所述陰離子層析柱所用樹脂為DE52或QAE Sephadex A-25樹脂。 所述陽離子層析柱所用樹脂為D152或CM Sephrose CL-6B樹脂。 所述檸檬酸-檸檬酸鈉和醋酸-醋酸鈉平衡緩沖液的濃度均為20mmol/L。 按照6.25mg/mL-12.5mg/mL 柱體積上樣。 所述蝦為凡納濱對蝦。 與現有技術相比，本專利技術的有益效果是: 1、本專利技術的純化方法通過陰離子交換層析和陽離子交換層析的結合，并通過調節層析所用緩沖液及其PH值，使得目的蛋白存在于穿柱峰中，能夠很好的保持蛋白的活性，獲得的蛋白純度高，而且，通過兩步離子交換層析法，處理量大，操作簡單，有利于大規模生產。 2、本專利技術的純化方法所用儀器及所用的試劑等耗材價格低廉，降低了生產成本。 【專利附圖】【附圖說明】 圖1所示為本專利技術按照實施例1的方法所得蝦原肌球蛋白樣品在檢測波長為280nm下HPLC法純度檢測色譜圖； 圖2所示為按照實施例2所得蝦原肌球蛋白蛋白樣品在檢測波長為280nm下HPLC法純度檢測色譜圖； 圖3所示為按照實施例3所得蝦原肌球蛋白蛋白樣品在檢測波長為280nm下HPLC法純度檢測色譜圖； 圖4所示為按照實施例4所得蝦原肌球蛋白蛋白樣品在檢測波長為280nm下HPLC法純度檢測色譜圖。 【具體實施方式】 以下結合附圖和具體實施例對本專利技術作進一步詳細說明。 本專利技術中的蝦原肌球蛋白粗品可以采用現有技術的方法獲得，本專利技術的實施例中采用通過有機溶劑除去脂質以及鹽析法技術獲得蝦原肌球蛋白粗品。 實施例1 (1)蝦原肌球蛋白粗品的制備: ①取10g去頭、去殼、去腸線的凡納濱對蝦，加入100mL濃度為0.9%的氯化鈉溶液后，勻漿；再按1:10(m/v)加入到100mL pH值為7.5、濃度為20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，其中，濃度為20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中含50mmol/L KCl。4000 Xg離心后棄去上清液，取沉淀物。將沉淀物再溶于PH值為7.5、濃度為20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，離心收集沉淀，重復3次。 ②在上述沉淀中加入400倍體積的-200C預冷過夜的冷丙酮200mL，封口，在0°C下用磁力攪拌器充分混勻30min，于4000 X g離心lOmin，收集沉淀物，沉淀物重復“混勻-離心”步驟兩次后將沉淀物轉移至干凈的濾紙上，在室溫下空氣中風干，得到蝦纖維蛋白丙酮粉，約有1go ③取5g所得的蟲下纖維蛋白丙酮粉,加入含lmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)的抽提液75mL，在4°C條件下抽提過夜。之后4000 X g離心30min，取上清液，所得沉淀物繼續靜提4h，離心棄沉淀取上清液。合并兩次上清液得到蝦原肌球蛋白粗提液。 ④將蝦原肌球蛋白粗提液稀釋一倍后，加入硫酸銨粉末使硫酸銨飽和度達到18%,4000Xg離心30min,棄沉淀取上清液繼續加入硫酸銨粉末，使硫本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種蝦原肌球蛋白的純化方法，其特征在于，包括下述步驟：(1)將蝦原肌球蛋白粗品溶于pH值為3.2?3.6的平衡緩沖液中得到樣品液，將所得樣品液加入到陰離子層析柱中，再用pH值為3.2?3.6的所述平衡緩沖液洗脫，收集穿柱峰所對應的溶液；(2)調節步驟(1)收集到的穿柱峰所對應的溶液的pH值為5.8?6.0，然后加入到陽離子層析柱中，再用pH值為5.8?6.0的所述平衡緩沖液洗脫，收集穿柱峰所對應的溶液，于4℃下透析除鹽、干燥，獲得高純度的蝦原肌球蛋白。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：吳子健，薛璐，胡志和，李洋，
申請(專利權)人：天津商業大學，
類型：發明
國別省市：天津;12