共同輕鏈小鼠制造技術

本發明專利技術提供遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠表達特征為有限的輕鏈可變區的免疫球蛋白輕鏈群。本發明專利技術提供小鼠，其從它們生殖系中有限群表達只有一個或幾個免疫球蛋白輕鏈可變區。本發明專利技術提供在小鼠中制備輕鏈可變區的方法，包括人輕鏈可變區。本發明專利技術提供制備適用于多特異性結合蛋白(例如雙特異性抗體)的人可變區的方法。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】共同輕鏈小鼠
本專利技術提供一種遺傳修飾小鼠，其表達具有與不同的人可變/小鼠恒定重鏈締合的共同人可變/小鼠恒定輕鏈的抗體。本專利技術提供一種從小鼠的B細胞的人可變區基因序列制備人雙特異性抗體的方法。
技術介紹
抗體通常包括同源二聚化重鏈組分，其中每條重鏈單體與相同的輕鏈相締合。期望具有異源二聚化組分的抗體(例如，雙特異性抗體)作為治療性抗體。但制備具有可以令人滿意地與雙特異性抗體的每條重鏈締合的合適輕鏈組分已被證明是存在問題的。在一個方法中，輕鏈可以通過調查所有輕鏈可變區使用的統計數據、鑒定人抗體中最常用的輕鏈并在體外將輕鏈與具有不同特異性的兩條重鏈配對來選擇。在另一個方法中，輕鏈可以通過觀察噬菌體展示文庫(例如包括人輕鏈可變區序列的噬菌體展示文庫，例如，人scFv文庫)中的輕鏈序列并從所述文庫中選擇最常用的輕鏈可變區來選擇。然后，所述輕鏈可以在所感興趣的兩條不同重鏈上測試。在另一個方法中，輕鏈可以通過采用感興趣的兩條重鏈的重鏈可變序列作為探針分析輕鏈可變序列的噬菌體展示文庫來選擇。與兩條重鏈可變序列均相締合的輕鏈可以選作所述重鏈的輕鏈。在另一個方法中，候選輕鏈可以與重鏈的關聯(cognate)輕鏈比對，并且對輕鏈作出修飾以更加接近地匹配兩條重鏈的關聯輕鏈通用的序列特征。如果需要將免疫原性的機率最小化，所述修飾優選得到已知存在于人輕鏈序列中的序列，使得基于本領域已知用于評估免疫原性的可能性的參數和方法蛋白水解處理不太可能產生T細胞表位(即，計算機分析以及濕法分析(wetassays))。上述所有方法依賴于包含許多先驗限制的體外方法，所述先驗限制例如，序列同一性、與特定預先選擇的重鏈相締合的能力，等等。本領域需要不依賴于操作體外條件而是采用更加生物學上可行的方法來制備包括共同輕鏈的人表位結合蛋白的組合物和方法。專利技術概述本專利技術提供表達人免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區的遺傳修飾小鼠，其中所述小鼠具有有限的輕鏈可變群(repertoire)。本專利技術提供一種產生人輕鏈可變區的生物系統，所述人輕鏈可變區與不同群的親和力成熟的人重鏈可變區締合并與其一起表達。本專利技術提供制備包括免疫球蛋白可變區的結合蛋白的方法，包括用感興趣的抗原免疫具有有限的免疫球蛋白輕鏈群的小鼠，以及將小鼠的免疫球蛋白可變區基因序列應用于特異性結合感興趣的抗原的結合蛋白中。方法包括用于制備適用于制備多特異性抗原結合蛋白的人免疫球蛋白重鏈可變區的方法。本專利技術提供遺傳工程小鼠，其選擇源自一群未重排的人重鏈可變區基因片段的合適的親和力成熟的人免疫球蛋白重鏈可變區，其中所述親和力成熟的人免疫球蛋白重鏈可變區締合源自一種人輕鏈可變區基因片段的單一人輕鏈可變區(singlehumanlightchainvariabledomain)并與其一起表達。本專利技術還提供遺傳工程小鼠，其提出了兩種人輕鏈可變區基因片段的選擇。本專利技術提供遺傳工程小鼠，其從有限群的人輕鏈可變區基因片段表達有限群的人輕鏈可變區，或單一人輕鏈可變區。所述小鼠遺傳工程化以包括單一未重排的人輕鏈可變區基因片段(或兩種人輕鏈可變區基因片段)，其表達單一輕鏈(或表達兩種輕鏈之一或二者)的重排以形成重排的人輕鏈可變區基因(或兩種重排輕鏈可變區基因)。所述重排的人輕鏈可變區能夠與由所述小鼠所選出的大量親和力成熟的人重鏈配對，其中所述重鏈可變區特異性結合不同表位。本專利技術提供遺傳工程小鼠，其從有限群的人輕鏈可變區序列表達有限群的人輕鏈可變區，或單一人輕鏈可變區。所述小鼠遺傳工程化以包括單一的V/J人輕鏈序列(或兩條V/J序列)，其表達單一輕鏈可變區(或其表達兩種可變區之一或二者)。包括所述可變序列的輕鏈能夠與由所述小鼠所克隆選出的大量親和力成熟的人重鏈配對，其中所述重鏈可變區特異性結合不同表位。在一個方面，本專利技術提供一種遺傳修飾的小鼠，其包括能夠與人J基因片段(從一個或大量JL片段選擇)重排并編碼免疫球蛋白輕鏈的人VL區的單一人免疫球蛋白輕鏈可變(VL)區基因片段。在另一個方面，所述小鼠包括不多于兩種人VL基因片段，其每一個能夠與人J基因片段(從一個或大量JL片段選擇)重排并編碼免疫球蛋白輕鏈的人VL區。在一個實施方案中，所述單一人VL基因片段可操作性連接選自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5的人JL片段，其中所述單一人VL基因片段能夠與所述一種或多種人JL片段的任何一個重排以形成編碼輕鏈可變區基因的序列。在一個實施方案中，所述遺傳修飾的小鼠包括免疫球蛋白輕鏈基因座(locus)，其不包括能夠重排以形成免疫球蛋白輕鏈基因的內源性小鼠VL基因，其中所述VL基因座包括能夠重排以編碼輕鏈基因的VL區的單一人VL基因片段。在一個具體的實施方案中，所述人VL基因片段是人Vκ1-39Jκ5基因片段或人Vκ3-20Jκ1基因片段。在一個實施方案中，所述遺傳修飾的小鼠包括VL基因座，其不包括能夠重排以形成免疫球蛋白輕鏈基因的內源性小鼠VL基因，其中所述VL基因座包括能夠重排以編碼輕鏈基因的VL區的不多于兩種人VL基因片段。在一個具體的實施方案中，所述不多于兩種人VL基因片段是人Vκ1-39Jκ5基因片段和人Vκ3-20Jκ1基因片段。在一個方面，本專利技術提供一種遺傳修飾的小鼠，其包括編碼人免疫球蛋白輕鏈的VL區的單一重排(V/J)人免疫球蛋白輕鏈可變(VL)區(即VL/JL區)。在另一個方面，所述小鼠包括能夠編碼人免疫球蛋白輕鏈的VL區的不多于兩種重排的人VL區。在一個實施方案中，所述VL區是重排的人Vκ1-39/J序列或重排的人Vκ3-20/J序列。在一個實施方案中，所述重排的人VL/JL序列的JL片段選自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4和Jκ5。在一個具體的實施方案中，所述VL區是人Vκ1-39Jκ5序列或人Vκ3-20Jκ1序列。在一個具體的實施方案中，所述小鼠具有人Vκ1-39Jκ5序列和人Vκ3-20Jκ1序列。在一個實施方案中，所述人VL基因片段可操作性連接人或小鼠前導序列。在一個實施方案中，所述前導序列是小鼠前導序列。在一個具體的實施方案中，所述小鼠前導序列是小鼠Vκ3-7前導序列。在一個具體的實施方案中，所述前導序列可操作性連接未重排的人VL基因片段。在一個具體的實施方案中，所述前導序列可操作性連接重排的人VL/JL序列。在一個實施方案中，所述VL基因片段可操作性連接免疫球蛋白啟動子序列。在一個實施方案中，所述啟動子序列是人啟動子序列。在一個具體的實施方案中，所述人啟動子序列是人Vκ3-15啟動子。在一個具體的實施方案中，所述啟動子可操作性連接未重排的人VL基因片段。在一個具體的實施方案中，所述啟動子可操作性連接重排的人VL/JL序列。在一個實施方案中，所述輕鏈基因座包括5’側接(相對于VL基因片段的轉錄方向)人免疫球蛋白啟動子并3’側接人VL基因片段的前導序列，所述人VL基因片段與人J片段重排并編碼包括內源性小鼠輕鏈恒定區(CL)的反向嵌合輕鏈的VL區。在一個具體的實施方案中，所述VL基因片段位于小鼠Vκ基因座，并且所述小鼠CL是小鼠Cκ。在一個實施方案中，所述輕鏈基因座包括5’側接(相對于VL基因片段的轉錄方向)人免疫球蛋白啟動子并3’側接重排的人VL區(VL/JL序列)的前導序列，并且所述重排的人VL本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種響應抗原挑戰表達一群抗原特異性抗體的小鼠，其中所述一群抗原特異性抗體的所有免疫球蛋白輕鏈包括源自相同的單一人VL基因片段的人輕鏈可變(VL)區以及免疫球蛋白重鏈包括源自人VH基因片段的人重鏈可變(VH)區，所述人VH基因片段選自VH1?2、VH1?3、VH1?8、VH1?18、VH1?24、VH1?46、VH1?58、VH1?69、VH2?5、VH2?26、VH2?70、VH3?7、VH3?9、VH3?11、VH3?13、VH3?15、VH3?20、VH3?21、VH3?23、VH3?30、VH3?33、VH3?43、VH3?48、VH3?53、VH3?64、VH3?72、VH3?73、VH4?31、VH4?34、VH4?39、VH4?59、VH5?51、VH6?1。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2012.03.06 US 13/412,9361.一種遺傳修飾的小鼠在制備抗體中的用途，所述抗體包含第一免疫球蛋白重鏈，所述第一免疫球蛋白重鏈包含源自人VH基因片段的第一人免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述人VH基因片段選自VH1-46、VH2-26、VH3-21和VH3-64，所述遺傳修飾的小鼠包含B細胞的一個群，各B細胞表達源自一個重排的人Vκ1-39/Jκ序列的人免疫球蛋白輕鏈可變區編碼的人免疫球蛋白輕鏈可變結構域，所述重排的人Vκ1-39/Jκ序列存在于所述小鼠的生殖系中，該重排的人Vκ1-39/Jκ序列與免疫球蛋白輕鏈恒定區可操作性連接，其中所述群的所述B細胞包括至少一個這樣的B細胞，該B細胞表達源自人VH基因片段的人免疫球蛋白重鏈可變區編碼的第一人免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述人VH基因片段選自VH1-46、VH2-26、VH3-21和VH3-64。2.根據權利要求1的用途，其中所述群的所述B細胞一起表達源自各人VH基因片段的人免疫球蛋白重鏈可變區編碼的人免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述人VH基因片段選自VH1-46、VH2-26、VH3-21和VH3-64。3.根據權利要求1的用途，其中所述群中的各所述B細胞表達由源自所述重排的人Vκ1-39/Jκ序列的人免疫球蛋白輕鏈可變區編碼的人免疫球蛋白輕鏈可變結構域，其與所述重排的人Vκ1-39/Jκ序列相同或者是其體細胞突變的變體。4.根據權利要求1的用途，其中(a)所述重排的人Vκ1-39/Jκ序列是重排的人Vκ1-39/Jκ5序列；(b)所述重排的人Vκ1-39/Jκ序列與小鼠Cκ區可操作性連接；(c)一種在小鼠中編碼所述第一人免疫球蛋白重鏈可變結構域的人免疫球蛋白重鏈可變區與一種小鼠免疫球蛋白重鏈恒定(CH)區可操作性連接，所述重鏈恒定區選自CH1、鉸鏈區、CH2、CH3、或其組合；和/或(d)所述在小鼠中編碼所述第一人免疫球蛋白重鏈可變結構域的人免疫球蛋白重鏈可變區自內源性免疫球蛋白重鏈基因座表達。5.根據權利要求1的用途，其中所述重排的人Vκ1-39/Jκ序列是:(a)如此定位，使得其替換內源性未重排的免疫球蛋白Vκ基因片段和內源性未重排的免疫球蛋白Jκ基因片段；(b)如此定位，使得其替換全部功能性內源性未重排的免疫球蛋白Vκ基因片段和全部功能性內源性未重排的免疫球蛋白Jκ基因片段；和/或(c)可操作性連接小鼠免疫球蛋白輕鏈恒定區或大鼠免疫球蛋白輕鏈恒定區。6.根據權利要求1的用途，其中所述抗體包含源自一個重排的人Vκ1-39/Jκ序列或源自其體細胞突變的變體的免疫球蛋白輕鏈。7.根據權利要求1的用途，其中所述第一免疫球蛋白重鏈源自第一人免疫球蛋白重鏈可變區，其選自所述小鼠的B細胞并且與源自一個重排的人Vκ1-39/Jκ序列或源自其體細胞突變的變體的免疫球蛋白輕鏈配對，其中所述免疫球蛋白輕鏈包含由人免疫球蛋白輕鏈可變區編碼的人免疫球蛋白輕鏈可變結構域。8.根據權利要求1的用途，其中所述抗體包含第二免疫球蛋白重鏈，所述第二免疫球蛋白重鏈包含由人免疫球蛋白重鏈可變區編碼的第二人免疫球蛋白重鏈可變結構域，所述人免疫球蛋白重鏈可變區源自人VH基因片段，所述VH基因片段選自VH1-46、VH2-26、VH3-21和VH3-64。9.根據權利要求1的用途，其中所述抗體包含第二免疫球蛋白重鏈，并且所述第一免疫球蛋白重鏈和所述第二免疫球蛋白重鏈之一或兩者包含從獲自所述小鼠的B細胞的人免疫球蛋白重鏈可變區表達的人重鏈可變結構域。10.根據權利要求1的用途，其中制備所述抗體包括在細胞中一起表達所述第一免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白重鏈，所述細胞還表達源自一個重排的人Vκ1-39/Jκ序列的免疫球蛋白輕鏈。11.根據權利要求1的用途，其中所述第一人免疫球蛋白重鏈的第一人免疫球蛋白重鏈可變結構域通過以下方式進行選擇：用感興趣的抗原免疫所述小鼠，測定由所述小鼠的B細胞表達的人免疫球蛋白重鏈可變區的序列，以及在細胞中表達所述第一人免疫球蛋白重鏈可變區的序列。12.根據權利要求1的用途，其中制備所述抗體包括選擇所述第一免疫球蛋白重鏈，該第一免疫球蛋白重鏈包含在B細胞的所述群中發現的人免疫球蛋白重鏈可變結構域，以及選擇不同的第二免疫球蛋白重鏈，該第二免疫球蛋白重鏈包含在B細胞的所述群中發現的第二人免疫球蛋白重鏈可變結構域，以及使用所述第一免疫球蛋白重鏈和所述第二免疫球蛋白重鏈來制備雙特異性抗體。13.根據權利要求1的用途，其中制備所述抗體包括選擇所述第一免疫球蛋白重鏈，該第一免疫球蛋白重鏈包含在所述小鼠中包含的B細胞的所述群中發現的第一人免疫球蛋白重鏈可變結構域，以及選擇不同的第二免疫球蛋白重鏈，該第二免疫球蛋白重鏈包含在不同的第二小鼠中包含的B細胞的群中發現的第二人免疫球蛋白重鏈可變結構域，該所述第二小鼠的B細胞的第...

【專利技術屬性】
技術研發人員：R·巴布，J·麥克沃特，L·麥克唐納，S·史蒂文斯，S·戴維斯，D·R·巴克勒，K·A·馬爾，A·J·莫菲，
申請(專利權)人：瑞澤恩制藥公司，
類型：發明
國別省市：美國;US