一種早代鑒定轉基因玉米純合體的方法技術

本發明專利技術公開了早代鑒定轉基因玉米純合體的方法，包括以下步驟：A1、提取T1代轉基因玉米DNA；A2、選擇參照基因、設計目的基因和參照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法對陽性T1代轉基因植株進行預檢測；A4、證明基因特異擴增，獲得基因擴增效率；A5、計算目的基因在各T1代植株中的相對含量；A6、檢出轉基因玉米純合體，當目的基因相對含量約等于1時，該植株為純合體；當基因相對含量約等于0.5時，該植株為雜合體。僅通過簡單的普通PCR和熒光定量PCR等操作，同時對T1代陽性植株中參考基因與目的基因Ct比值進行分析，即能對單拷貝轉基因玉米在T1代高效、簡易地鑒定出純合體。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及農業育種
，尤其涉及的是一種早代鑒定轉基因玉米純合體的簡易方法。
技術介紹
玉米已成為全球種植面積最大的糧、經、飼三元谷類作物，隨著分子生物學和生物技術的發展，玉米轉基因技術已經成為研究玉米基因功能和創制高抗、優質、高產玉米新品種的重要手段之一。而鑒定目的基因純合的玉米轉化體是玉米轉基因技術中一個必不可少的環節。由于轉基因沉默現象的存在，人們往往選擇目的基因以單拷貝或低拷貝形式插入 的轉基因TO代進行下一步的純合體篩選。常規的方法是對TO代(轉基因當代)轉化體自交獲得Tl代轉基因植株，然后對每個獨立分離的Tl代轉基因植株產生的T2代個體進行轉基因分離比率的研究。通常采用PCR方法鑒定出T2代不再分離的轉基因株系(即不再出現不含目的基因植株的株系)，被鑒定為純合的轉基因株系，此方法不僅工作量大、而且成本高、周期長，不利于快速獲得純合的轉基因株系和轉基因玉米新品種的育成。2009年劉楠等建立了一種利用4個PCR引物的多重PCR反應來鑒定轉基因玉米純合體的方法，用該方法鑒定玉米轉基因純合體的前提條件是目的基因在玉米基因組DNA中插入位點序列已知。而弄清楚某個外源目的基因在植物基因組中的插入位點則是轉基因檢測中另外一個技術難題，且操作繁瑣，需要較長的周期，尤其是對一些研究體系不夠完善的科研單位。對于很多轉基因玉米而言，在Tl代尚未鑒定出目的基因在玉米基因組DNA的插入位點，因此該方法在早代鑒定出轉基因玉米純合體的應用上還受到很大的限制。2004年，杜春芳等提出了用基于TaqMan探針的雙重定量PCR技術來鑒定Tl代轉基因純合體。該技術在定量PCR反應體系中，加入2對PCR引物和TaqMan探針。第I對為擴增目的基因的引物和探針，另I對為擴增參考基因的引物和探針。而目的基因和參考基因TaqMan探針5’端標記了不同的熒光報告基團，可在同一 PCR反應中同時擴增目的基因和參考基因，根據熒光信號的強弱分別計算出樣品中目的就基因和參考基因的Ct值，繼而得出二者間的比例，并以此鑒定出純合的Tl代轉基因植株?；赥aqMan探針的雙重定量PCR技術的缺點主要表現在以下幾個方面，一是探針設計難度大，既要避免二級結構，又要嚴格控制GC含量，避免重復的核酸序列，避免引物與探針形成互補，否則極大影響擴增效率導致檢測結果不準確。其二，探針的合成和雙熒光標記成本高，且不能通過溶解曲線判斷擴增產物的特異性。其三，該方法主要用于鑒定雙子葉植物煙草和擬南芥轉基因純合體。而在不依賴于已知目的基因插入位點及側翼序列的情況下，如何快速、簡易地鑒定出轉基因玉米純合體，目前還未見相關方法報道。
技術實現思路
為解決針對傳統技術及現有相關技術的存在的缺點，專利技術了一種不依賴于目的基因在玉米基因組中插入位點，且低成本、高效率、操作簡易的轉基因玉米純合體的早代檢測方法，即基于SYBR Green I染料熒光定量PCR技術的轉基因玉米純合體早代鑒定方法。本專利技術技術方案如下 ，包括以下步驟A1、提取Tl代轉基因玉米DNA ;A2、選擇參照基因、設計目的基因和參照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法對陽性Tl代轉基因植株進行預檢測；A4、證明基因特異擴增，獲得基因擴增效率;A5、計算目的基因在各Tl代植株中的相對含量;A6、檢出轉基因玉米純合體，當目的基因相對含量約等于I時，該植株為純合體；當基因相對含量約等于O. 5時，該植株為雜合體。SYBR Green I是一種結合于所有DNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，在PCR反應過程中隨著擴增產物的積累熒光信號不斷增強，可以根據熒光信號強弱分辨樣品間僅2倍起始DNA和RNA水平上的差異。目前已廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化以及比較不同組織或細胞中的mRNA表達差異。鑒于Tl代單拷貝轉基因株系中雜合體和純合體最本質的區別是，在雜合體中目的基因只存在于同源染色體的中的一條染色體，而純合體中目的基因則同時存在于同源染色體中的兩條染色體，即純合體中目的基因含量是雜合體中的2倍。這種差異可以被基于SYBR Green I染料的熒光定量PCR技術靈敏地檢出。本專利技術利用低成本的SYBR Green I作為熒光染料，建立了基于熒光定量PCR的快速轉基因玉米純合體檢測技術。由于基于SYBG Green I的熒光定量PCR技術不需要設計復雜的特異探針，降低了整個技術的難度，同時也極大的減少了技術成本。另外，無須了解目的基因在植物基因組中的整合位點和側翼序列，以玉米基因組中的單拷貝基因為參照基因，僅通過簡單的普通PCR和熒光定量PCR等操作，同時對Tl代陽性植株中參考基因與目的基因Ct比值進行分析，即能對單拷貝轉基因玉米在Tl代高效、簡易地鑒定出純合體。本專利技術適用于對單拷貝轉基因玉米進行早代純合體的鑒定。附圖說明圖I :參考基因6觀2] 26167856標準曲線，擴增效率94.2%，相關系數0.998 ；圖2 :目的基因bar標準曲線，擴增效率94.5%，相關系數O. 997 ；圖3 :參考基因GRMZM2G167856的溶解曲線，溶解峰單一，產物Tm在80_90°C ；圖4:目的基因bar的溶解曲線，溶解峰單一，產物Tm在80_90°C ；圖5 :含bar基因的表達載體；圖6 =Southern雜交鑒定TO代目的基因拷貝數；圖7 :來自于同一 TO代植株的9個Tl植株PCR擴增出特異條帶，方框處表示擴增出的特異性目的條帶；圖8 =Tl-I植株對應的T2代株系PCR擴增bar基因情況；圖9 Τ1-3植株對應的Τ2代株系PCR擴增bar基因情況；圖10 Τ1-4植株對應的Τ2代株系PCR擴增bar基因情況；圖11 Τ1-8植株對應的Τ2代株系PCR擴增bar基因情況，圖中O表示未擴增出bar基因特異條帶的植株，I表示擴增出bar基因特異條帶的植株；具體實施例方式以下結合具體實施例，對本專利技術進行詳細說明。2. 2. ITl代轉基因玉米DNA提取對單個陽性TO轉基因玉米進行人工套袋自交，獲得TO代果穗。從每個TO代植株收獲的一穗種子進行單粒播種，獲得對應的Tl代轉基因植株，并進行編號。對來自同一個TO代的Tl代植株，隨機抽取20株左右，在3-4葉期分別提取葉片總DNA。I)取葉片2g，剪碎后于液氮中迅速研磨成粉(研磨后的葉片占離心管體積的1/4到 1/3)。 2)將上述凍粉迅速轉入預冷的離心管中，迅速加入900 μ I已預熱到65°C的CTAB提取液中，迅速混勻，于65°C水浴40min。期間輕柔混勻3 4次(每隔IOmin混勻一次)。3)取出離心管，冷至室溫，加入等體積(ΙΟΟΟμ I)的氯仿-異戊醇(氯仿異戊醇=24 : I, ν/ν),在搖床上輕輕振蕩搖勻lOmin。4)室溫下離心IOmin (IOOOOrpm)，取上清液轉至新的2ml離心管中，再加入ΙΟΟΟμ I的24 : I的氯仿-異戊醇，在搖床上輕輕振蕩搖勻lOmin。5)室溫下離心IOmin(IOOOOrpm),取上清液至新的2ml離心管中，加入等體積已預冷至_20°C的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種早代鑒定轉基因玉米純合體的方法，其特征在于，包括以下步驟：A1、提取T1代轉基因玉米DNA；A2、選擇參照基因、設計目的基因和參照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法對陽性T1代轉基因植株進行預檢測；A4、證明基因特異擴增，獲得基因擴增效率；A5、計算目的基因在各T1代植株中的相對含量；A6、檢出轉基因玉米純合體，當目的基因相對含量約等于1時，該植株為純合體；當基因相對含量約等于0.5時，該植株為雜合體。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：沈亞歐，潘光堂，彭煥偉，葛飛，張志明，林海建，江舟，趙茂俊，楊珊，羅旭，張兵，
申請(專利權)人：四川農業大學，
類型：發明
國別省市：