一種產毒微囊藻特異性多重PCR檢測方法及其試劑盒技術

本發明專利技術所要解決的技術問題在于，為了克服現有技術中存在的對產毒微囊藻檢測方法復雜、儀器要求高等問題，提供一種產毒微囊藻特異性多重PCR檢測方法及其試劑盒。一種產毒微囊藻特異性多重PCR檢測方法，包括如下步驟：(1)從檢測地取樣微囊藻，并提取基因組DNA；(2)設計合成微囊藻，包括產毒和非產毒株的ropC1基因和產毒微囊藻mcyA、mcyB、mcyD、mcyE、mcyI、mcyJ基因片段的7對引物；(3)使用上述設計的特異性引物分別進行PCR擴增反應，最后進行電泳凝膠檢測。本發明專利技術以多個基因作為分子指標，提高了檢測精度，操作簡便，易于掌握，可快速檢測出水體中的微囊藻，并能有效識別是否為產毒株。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物
，具體涉及一種產毒微囊藻特異性多重PCR檢測方法及其試劑盒。
技術介紹
自上世紀60年代起，就在太湖中發現了藍藻水華。到目前為止，不僅云南滇池、江蘇太湖、安徽巢湖、武漢東湖和上海淀山湖等大型淡水湖泊已經發生了嚴重的藍藻水華污染，而且長江、黃河以及珠江中下游的許多湖泊和水庫也都相繼發生了不同程度的藍藻水華。藍藻水華持續大面積的發生，極大地危害了水體生態系統的結構和功能，某些水華種類 產生的藻毒素對人類的健康也構成了直接或潛在的影響。如，微囊藻屬(Microcystis)-富營養化水庫水體中的常見的優勢藻類，隸屬于藍藻門、色球藻綱(Chroococcophyceae)、色球藻目(Chroococcales)、色球藻科(Chrococcaceae),其部分株系能產生微囊藻毒素。這種毒素是一種肝毒素，人類或動物長期飲用含有這一毒素的水體，可能會引發肝損傷甚至肝癌。正因為如此，各國廣泛開展快速檢測藻毒素及藻細胞的工作。現階段，用于檢測微囊藻毒素的方法眾多，先后研制出生物分析法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法、電化學免疫分析法、電化學生物傳感器檢測法、分子生物學檢測法等。但是，分子生物學檢測法可以靈敏、快速、準確、高效地檢測出物種，它不似高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法、電化學免疫分析法、電化學生物傳感器檢測法等對儀器要求過高，僅靠一臺PCR儀即可實現快速檢測，費用也相對低廉，在定性及定量實驗中已取得較好效果，備受研究人員青睞。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題在于，為了克服現有技術中存在的對產毒微囊藻檢測方法復雜、儀器要求高等問題，提供一種對產毒微囊藻特異性檢測的多重PCR方法及其所使用的試劑盒。為了解決現有技術中的這些問題，在第一個方面，本專利技術提供的技術方案是一種產毒微囊藻特異性多重PCR檢測方法，包括如下步驟(I).從檢測地取樣微囊藻，并提取基因組DNA，(2).設計并合成微囊藻，包括產毒和非產毒株的ropCl基因和產毒微囊藻mcyA、mcyB、mcyD、mcyE、mcyl> mcyj 基因片段的 7 對引物引物序列(5’一3’)rpoC ITCFl CAGTTATCTCAGTATCCTGCTCG,rpoC ITCRl ACTTCATCCAAGACGTGCC ；mcyA TCFl GCATCGGAGACAGAAACAGG,mcyA TCRl AAGTTACCCAAACCGAAAGG ；mcyB TCFl CCAAACTGGTGCCGAATC,mcyB TCRl CAAGATGACAAAGGCAGAAGG ；mcyD TCFl GCCATTTAGAAGGTGCTGC,mcyD TCRl GGCTGAGTGATTTGGGTTTC ；mcyE TCFl CAAACTGCTCCAGGTATCATTG,mcyE TCRl TGAGTCTGGGAGATTAAAGTCG ；mcyl TCFl TTGGTACTCTGGTGGCTCAC,mcyl TCRl CTCCTCCTGAAGCACTTGTAAT ；mcyj TCFl TGACCGCTTTAGAATGTGCT, mcyj TCRl ACTAATTCCTTGGCTAATCTGG(3).使用上述設計的特異性引物分別進行PCR擴增反應，最后進行電泳凝膠檢測。所述的微囊藻種類，包括但不限于銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、綠色微囊藻(Microcystis viridis)、惠氏微囊藻(Microcystis wesenbergii)、水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)、華美微囊藻(Microcystis elabens)、魚害微囊藻(Microcystis ichthyoblabe)等。在上述的檢測方法中，專利技術人設計針對微囊藻中編碼RNA聚合酶Y亞基的IOpCl基因特異性擴增的引物，該引物僅能擴增微囊藻屬藻株，可有效區分微囊藻及其他藻株；所設計的mcyABDEIJ引物可將微囊藻中含有微囊藻毒素合成酶基因(mcy genes)及未含有該基因的藻株區分。專利技術人設計多重PCR方法以檢測微囊藻的目的在于，實際PCR檢測過程中，部分因素或多或少會對PCR擴增產生干擾，以至于產生假陰性結果，此時，以單一目的條帶為檢測基準的方法無法擴增出目的片段，至此判斷無陽性結果，造成實驗誤差。多重PCR檢測方法則極大提高檢測效果，削弱未知因素的干擾強度，以多條目的片段為檢測指標，達到較為準確的檢測。同時，多重PCR的檢測靈敏度優于普通PCR檢測的檢測靈敏度，通過調整及優化實驗方案，檢測效率更高，擴增時間也大為縮短。為了解決現有技術中的這些問題，在第二個方面，本專利技術提供的技術方案是一種產毒微囊藻特異性多重PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括如下的引物引物序列(5’一3’)rpoCl TCFl CAGTTATCTCAGTATCCTGCTCG,rpoCl TCRl ACTTCATCCAAGACGTGCC ；mcyA TCFl GCATCGGAGACAGAAACAGG,mcyA TCRl AAGTTACCCAAACCGAAAGG ；mcyB TCFl CCAAACTGGTGCCGAATC,mcyB TCRl CAAGATGACAAAGGCAGAAGG ；mcyD TCFl GCCATTTAGAAGGTGCTGC,mcyD TCRl GGCTGAGTGATTTGGGTTTC ；mcyE TCFl CAAACTGCTCCAGGTATCATTG,mcyE TCRl TGAGTCTGGGAGATTAAAGTCG ；mcyl TCFl TTGGTACTCTGGTGGCTCAC,mcyl TCRl CTCCTCCTGAAGCACTTGTAAT ；mcyj TCFl TGACCGCTTTAGAATGTGCT,mcyj TCRl ACTAATTCCTTGGCTAATCTGG。所述的可檢測的產毒微囊藻種類，包括但不限于銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)、綠色微囊藻(Microcystis viridis)、惠氏微囊藻(Microcystiswesenbergii)、水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)、華美微囊藻(Microcystiselabens)、魚害微囊藻(Microcystis ichthyoblabe)等。一種微囊藻mcy基因調控微囊藻毒素的合成，僅存在于產毒種體內，是用于區分產毒與非產毒藻種良好的分子指標。它共分為十個片段(mcyA J)，包含兩個大型雙向轉錄操縱子(mcyABC和mcyDEFGHIJ)。不同片段行使不同的功能，mcyABC基因編碼五組NRPS模塊；mcyD基因調控兩組PKS模塊，而mcyE和mcyG基因混合 編碼NRP S-PK S區域。其他幾個基因(如mcyF和mcyHIJ)也直接或間接參與調控微囊藻毒素的合成。本專利技術針對不同的功能區(mcyABDEIJ片段)以及ropC I基因，設計特異性引物，通過PCR擴增片段長度間的差異，得以識別特異性片段。需要說明的是，由于ropCl基因針對微囊藻(包括產毒株和無毒株)設計，當檢測品中出現產毒株或無毒株本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種產毒微囊藻特異性多重PCR檢測方法，包括如下步驟：(1).從檢測地取樣微囊藻，并提取基因組DNA，(2).設計并合成微囊藻包括產毒和非產毒株的ropC1基因和產毒微囊藻mcyA、mcyB、mcyD、mcyE、mcyI、mcyJ基因片段的7對引物：引物???????序列(5’→3’)rpoC1?TCF1??CAGTTATCTCAGTATCCTGCTCG，rpoC1?TCR1??ACTTCATCCAAGACGTGCC；mcyA?TCF1???GCATCGGAGACAGAAACAGG，mcyA?TCR1???AAGTTACCCAAACCGAAAGG；mcyB?TCF1???CCAAACTGGTGCCGAATC，mcyB?TCR1???CAAGATGACAAAGGCAGAAGG；mcyD?TCF1???GCCATTTAGAAGGTGCTGC，mcyD?TCR1???GGCTGAGTGATTTGGGTTTC；mcyE?TCF1???CAAACTGCTCCAGGTATCATTG，mcyE?TCR1???TGAGTCTGGGAGATTAAAGTCG；mcyI?TCF1???TTGGTACTCTGGTGGCTCAC，mcyI?TCR1???CTCCTCCTGAAGCACTTGTAAT；mcyJ?TCF1???TGACCGCTTTAGAATGTGCT，mcyJ?TCR1???ACTAATTCCTTGGCTAATCTGG。(3).使用上述設計的特異性引物分別進行PCR擴增反應，最后進行電泳凝膠檢測。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：唐晨，董麗，饒濤，何培民，賈睿，
申請(專利權)人：上海海洋大學，
類型：發明
國別省市：