本發明專利技術涉及一種鑒別正品瑪咖、偽品瑪咖及摻雜瑪咖的ITS序列及方法。本發明專利技術公開了正品瑪咖的rDNAITS全序列及利用該序列鑒別真偽瑪咖的方法，包括提取總DNA，利用ITS區引物擴增，回收純化產物，連接載體并篩選陽性克隆，測序，序列比對，瑪咖真偽判別。本發明專利技術可有效檢測真偽瑪咖，瑪咖粉末中是否摻雜其它可能偽品，如蕪菁、蘿卜、玉米及土豆等，可靠穩定高效地對正品瑪咖、偽品瑪咖及摻雜瑪咖進行鑒定。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于植物種質資源的鑒定
，特別涉及一種新資源食品植物ー瑪咖的真偽鑒別核苷酸序列和鑒別方法。
技術介紹
瑪咖(Lepidium meyenii Walp.)為十字花科獨存菜屬一年生草本植物，原產南美洲海拔3500-4500m的安第斯山脈。瑪咖具有豐富的營養價值 ，當地印加人將其作為食物。此外，瑪咖還可提高生育能力，被用于解決荒寒高地人畜不育問題。隨著人們對瑪咖營養價值及藥用價值的了解，世界范圍內對瑪咖的需求也逐漸增多。目前，美國、日本、西班牙、厄瓜多爾、玻利維亞、澳大利亞等已相繼進行種植，但未形成規模。我國于2002年開始在云南麗江引種種植，目前已經成為全球最大的瑪咖種植基地。隨著科學研究的不斷深入，研究者發現瑪咖不僅具有提高生育能力的作用，還具有抗疲勞、緩解更年期綜合癥狀、抗前列腺增生、抗氧化、延緩衰老及抗癌等重要功效。1992年聯合國糧農組織(FAO)將瑪咖作為營養補充劑向世界推薦；2001年美國食品與藥品管理局(FDA)批準了瑪咖保健藥品進入美國。瑪咖在國際市場上的需求逐漸增加，在中國市場的銷量也不斷提聞。巨大的經濟利益使得ー些不法分子利用與瑪咖相似的其他低價材料冒充瑪咖。我國獨荇菜屬植物一共有15種，均沒有膨大的根莖，而蘿卜屬的蘿卜和蕓薹屬的蕪菁的根莖在外形及氣味上與瑪咖具有較高相似性，被用來冒充瑪咖干片或參入瑪咖粉進行銷售。更有不法分子在瑪咖粉中參入一定比例的玉米粉或土豆粉以攫取非法利益。這些偽品的出現極大地傷害了消費者的權益。由于瑪咖引入我國僅10余年，還未出現對瑪咖進行真偽鑒別的有效的公開方法。目前從性狀、氣味及味道等方面對瑪咖干片及瑪咖粉進行鑒別難度極大；利用氣相、液相及質譜等方法分析瑪咖次生代謝產物的鑒別方法，一方面價格昂貴，且次生代謝產物因植株生長階段、環境影響等不同均會一定程度上影響產品成分含量，這就可能導致出現多重標準等。所以現在急需ー種既簡便又可靠且經濟的方法對正品瑪咖、偽品瑪咖及摻雜瑪咖進行鑒別。20世紀80年代以來，分子生物學技術的快速發展使人們認識到直接檢測DNA序列，可以從根本上避免由表型性狀或成分分析來推斷物種或品種時存在的問題。ITS序列是編碼核糖體RNA的核DNA序列，作為非編碼區，受外界環境因素影響小，承受的選擇壓カ較小，為屬以下水平的物種研究提供了便利，具有樣品用量少，鑒定精準等優點，目前被廣泛應用于藥用植物的鑒別。本專利技術的優勢在于，利于ITS序列通用引物對提取的DNA進行擴増，測序比對即可確認瑪咖植株、瑪咖干片及瑪咖粉是否為真正的瑪咖，是否摻雜，如摻雜，雜質為何種植物材料
技術實現思路
本專利技術主要目的是針對目前存在的偽品瑪咖及摻雜瑪咖，提供一種鑒別正品瑪咖、偽品瑪咖及摻雜瑪咖的核苷酸序列及方法，將該序列作為從DNA水平上進行瑪咖真偽鑒別的DNA商品條形碼。本專利技術解決其技術問題所用的技術方案是利用ITS序列通用引物ITS4和ITS5對麗江產黃、紅、黑三種瑪咖及秘魯產瑪咖進行ITS區序列擴增測序，結果表明麗江產黃、紅、黑三種瑪咖及秘魯產瑪咖的ITS序列高度保守，均為權利要求I中所述SEQ ID NO. I。利用上述ITS區序列鑒別正品瑪咖、偽品瑪咖及摻雜瑪咖的方法，包括以下步驟(I)總DNA的提取；(2) PCR擴增；(3) PCR產物電泳及染色；(4) PCR產物回收純化；(5)連接T載體；(6)轉化大腸桿菌；(7)陽性篩選;(8)測序；(9)序列比對及Blast ；真偽瑪咖鑒別。與現有技術相比，本專利技術的有益效果是·本專利技術提供了來源于麗江產不同顏色瑪咖及秘魯產瑪咖的rDNA ITS全序列，可用于對照鑒別正品瑪咖；通過從DNA水平上分析瑪咖及其可能偽品的遺傳特征，為區分瑪咖產品，如瑪咖鮮樣、瑪咖干樣、瑪咖干片、純瑪咖粉及其他可進行DNA提取的瑪咖產品等提供了有效的分子標記，同時為瑪咖產品的真偽鑒別及分析瑪咖系統發育地位奠定一定基礎。附圖說明圖I為提取瑪咖及其偽品蕪菁、蘿卜、玉米和土豆總DNA后，利用ITS區通用引物擴增得到700bp左右DNA片段。圖I中LYM為麗江產黃瑪咖，LRM為麗江產紅瑪咖，LBM為麗江產黑瑪咖，PM為秘魯產瑪咖，WJ為蕪菁，LB為蘿卜，YM為玉米，TD為土豆；圖2為瑪咖與蕪菁rDNAITS全區比對圖，其中序列maca為瑪咖，wj為蕪菁；圖3為瑪咖與蘿卜rDNAITS全區比對圖，其中序列maca為瑪咖，Ib為蘿卜；圖4為瑪咖與玉米rDNAITS全區比對圖，其中序列maca為瑪咖，ym為玉米；圖5為瑪咖與土豆rDNAITS全區比對圖，其中序列maca為瑪咖，td為土豆；具體實施例方式實施例I本實施例測定了 ITS通用引物ITS4和ITS5對麗江產黃、紅、黑瑪咖，秘魯產瑪咖，麗江產蕪菁，市售蘿卜、玉米及土豆的rDNA ITS序列的可擴增性，并比對了這8份材料的ITS區全序列，表明瑪咖ITS區具有高度保守性，與蕪菁、蘿卜、玉米及土豆的ITS區有巨大差異，瑪咖ITS全序列可作為瑪咖的商品條形碼以進行正品瑪咖與偽品瑪咖的判別，采用的方法包括如下具體步驟(I)總DNA的提取取麗江產黃、紅、黑瑪咖干片，秘魯產瑪咖粉，其偽品蕪菁干片，市售蘿卜葉片、市售玉米葉片及市售土豆塊根，利用Genestar試劑盒提取總DNA,具體方法按如下步驟操作①取各樣品少許，剪碎后放入預冷的研缽中，倒入液氮速凍，迅速將其磨成粉末，利用預冷的勺子裝入預冷的2ml離心管中，秘魯瑪咖粉不需研磨直接提取DNA ；②加入700 μ L試劑盒中A液，輕微震蕩混勻10s，于65°C水浴30min，15min時輕輕搖勻一次；③加入700 ii L氯仿異戊醇(24:1)混合液劇烈震蕩IOs后，12000rpm離心IOmin ；④200 ii L槍頭剪去尖頭，小心吸取上清轉移入I. 5mL新離心管中；⑤加入兩倍體積的預冷無水こ醇，緩慢搖勻后置于_20°C冰箱20min ；⑥用槍頭挑取絮狀DNA樣轉入裝有500mL預冷的70%こ醇的I. 5mL離心管中洗滌DNA ；⑦12000rpm離心5min,棄上清,置于37°C溫箱揮發剩余こ醇；⑧根據⑥中絮狀DNA大小適量加入50-100 U L DNA儲存液B溶解； ⑨檢測DNA濃度后取少量稀釋至20ng/ii L作為工作液，剰余部分_80°C保存備用；(2) PCR擴增選擇ITS通用引物的ITS4和ITS5作為引物進行擴增，引物序列如下ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ITS5 :5， -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，該引物由華大基因合成，用ddH20稀釋為10 PM。以總DNA為模版，按照以下體系和程序進行PCR反應；PCR 反應體系每 25 ii L 含有IOOng DNA 模版、2. 5 y L 含 Mg2+IOXBuffer, 5nmol4 XdNTP, I. 5U Taq 酶，正反引物各 IOpmol, 14. 7 u L ddH20 ；PCR 反應程序94°C預變性 5min，94°C變性 30s，52°C復性 30s，72°C延伸 lmin，35個循環，最后72°C延伸5min，4°C保存。(3)PCR產物電泳及染色利用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳，TAE做緩沖液進行電泳檢本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種鑒別正品瑪咖、偽品瑪咖及摻雜瑪咖的ITS區序列，其特征在于：所述核苷酸序列來源于麗江產黃、紅、黑瑪咖及秘魯產瑪咖的rDNAITS全序列，如SEQ?ID?NO.1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙兵，陳金金，王麗衛，趙慶生，王曉東，袁曉凡，
申請(專利權)人：中國科學院過程工程研究所，
類型：發明
國別省市：
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