本發明專利技術公開了一種工程菌及其在生產中長鏈3-羥基脂肪酸中的應用。本發明專利技術提供的工程菌，是將出發菌進行如下（a）和（b）的改造得到的重組菌：（a）滅活PHA合成酶基因；（b）導入硫酯酶基因；所述出發菌為產聚羥基脂肪酸酯的細菌。利用本發明專利技術提供的工程菌以某一中長鏈脂肪酸為單一碳源時，發酵液中可得到高產量、高純度的、與提供脂肪酸碳源的結構高度一致的3-羥基脂肪酸產物。本發明專利技術的方法可用于高產量、高純度的3-羥基脂肪酸的生產，應用前景廣闊。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及屬于基因工程和微生物發酵的領域，具體涉及一種工程菌及其在生產中長鏈3-羥基脂肪酸(3-HA)中的應用。
技術介紹
3-羥基脂肪酸(3-HA)是新型生物材料聚羥基脂肪酸酯(PHA)的常見單體。由于其特殊的手性結構，3-羥基脂肪酸在藥物、抗生素、維生素、香料及信息素的合成中可做為重要的前體。根據碳鏈骨架的長度，3-羥基脂肪酸可分為短鏈和中長鏈兩類前者的碳鏈長度 為3-5，后者的碳鏈長度為6-14。其中中長鏈3-羥基脂肪酸可作為抗癌藥物等重要藥物合成的前體。3-羥基脂肪酸傳統的生產方法是化學合成法，還可通過胞外PHA降解法和胞內PHA降解法等獲得。由于這些方法工藝復雜、生產投入大、產物純度不高，難以分離而導致生產成本高。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種工程菌及其在生產中長鏈3-羥基脂肪酸中的應用。本專利技術提供的工程菌，是將出發菌進行如下(a)和(b)的改造得到的重組菌(a)滅活PHA (聚羥基脂肪酸)合成酶基因；(b)導入硫酯酶基因；所述出發菌為產聚羥基脂肪酸酯的細菌。所述出發菌可為產聚羥基脂肪酸酯均聚物的細菌。所述PHA合成酶為將3-輕基脂肪酸乙酰輔酶A (3-hydroxyacyl-CoA)合成為聚羥基脂肪酸的酶。所述出發菌具體可為嗜蟲假單胞菌LAC25，它是嗜蟲假單胞菌L48的P -氧化代謝被削弱的突變體，其基因組中的fadA基因、fadB基因、PSEEN0664基因、PSEEN4635基因、PSEEN4636基因被敲除。所述“滅活PHA合成酶基因”是通過滅活PHA合成酶-降解酶操縱子基因實現的。所述PHA合成酶-降解酶操縱子基因包括phaCl基因、phaC2基因和phaZ基因；所述phaCl基因如序列表的序列I自5’末端第1-1680位核昔酸所不；所述phaZ基因如序列表的序列I自5’末端第1745-2584位核苷酸所示；所述phaC2基因如序列表的序列I自5’末端第2678-4357位核苷酸所示。所述PHA合成酶-降解酶操縱子基因具體如序列表的序列I所示。所述“滅活PHA合成酶-降解酶操縱子基因”具體可通過同源重組實現。用于所述同源重組的功能DNA片段中包括上游同源片段和下游同源片段。所述功能DNA片段中，在所述上游同源片段和所述下游同源片段之間還可具有篩選標記基因。所述篩選標記基因具體可為Gnf (硫酸慶大霉素抗性基因)基因。所述功能DNA片段中，所述上游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第10至510位核苷酸所示，所述下游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第1372至1835位核苷酸所示。所述Gnf基因具體可如序列表的序列4自5’末端第523-1356位核苷酸所示。所述功能DNA片段具體可如序列表的序列4自5’末端第10至1835位核苷酸所示。所述功能DNA片段具體通過重組質粒導入所述出發菌并與所述出發菌發生所述同源重組。所述重組質粒具體可為將所述功能DNA片段插入pKlSmobsacB質粒的多克隆位點得到的重組質粒。所述硫酯酶可如序列表的序列3所示或序列表的序列6所示。所述硫酯酶基因可如序列表的序列2或序列表的序列5所示。所述硫酯酶基因可通過質粒導入所述出發菌。 所述質粒為pSPH09質粒或重組質粒pZ⑶01。所述重組質粒pZ⑶01具體為將質粒中大腸桿菌來源的硫酯酶基因(該硫酯酶如序列表的序列3所示，該硫酯酶基因具體如序列表的序列2所示)替換為編碼序列表的序列6所示蛋白質的DNA分子(具體為序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子)得到的重組質粒。所述重組質粒pZ⑶01具體為將質粒pSPH09的NdeI和EcoRI酶切位點之間的小片段替換為編碼序列表的序列6所示蛋白質的DNA分子(具體為序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子)得到的重組質粒。本專利技術還保護一種工程菌，是將出發菌進行如下(a)和(b)的改造得到的重組菌Ca)滅活脂肪酸β氧化代謝途徑相關基因和PHA合成酶基因；(b)導入硫酯酶基因；所述出發菌為產聚羥基脂肪酸酯的細菌。所述PHA合成酶為將3-輕基脂肪酸乙酰輔酶A (3-hydroxyacyl-CoA)合成為聚羥基脂肪酸的酶。所述產聚羥基脂肪酸酯的細菌為能產一種或多種單體碳鏈長度不少于6的中長鏈單體輕基脂肪酸酯的菌株，優選為假單胞菌屬(Pseudomonas spp)菌株,更加優選為嗜蟲假單胞菌(Pseudomonas entomophila),進一步優選為嗜蟲假單胞菌L48。所述“滅活PHA合成酶基因”是通過滅活PHA合成酶-降解酶操縱子基因實現的。所述PHA合成酶-降解酶操縱子基因包括phaCl基因、phaC2基因和phaZ基因；所述phaCl基因如序列表的序列I自5’末端第1-1680位核昔酸所不；所述phaZ基因如序列表的序列I自5’末端第1745-2584位核苷酸所示；所述phaC2基因如序列表的序列I自5’末端第2678-4357位核苷酸所示。所述PHA合成酶-降解酶操縱子基因具體如序列表的序列I所示。所述“滅活PHA合成酶-降解酶操縱子基因”具體可通過同源重組實現。用于所述同源重組的功能DNA片段中包括上游同源片段和下游同源片段。所述功能DNA片段中，在所述上游同源片段和所述下游同源片段之間還可具有篩選標記基因。所述篩選標記基因具體可為Gnf (硫酸慶大霉素抗性基因)基因。所述功能DNA片段中，所述上游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第10至510位核苷酸所示，所述下游同源片段可如序列表的序列4自5’末端第1372至1835位核苷酸所示。所述Gnf基因具體可如序列表的序列4自5’末端第523-1356位核苷酸所示。所述功能DNA片段具體可如序列表的序列4自5’末端第10至1835位核苷酸所示。所述功能DNA片段具體通過重組質粒導入所述出發菌并與所述出發菌發生所述同源重組。所述重組質粒具體可為將所述功能DNA片段插入pKlSmobsacB質粒的多克隆位點得到的重組質粒。所述硫酯酶可如序列表的序列3所示或序列表的序列6所示。所述硫酯酶基因可如序列表的序列2或序列表的序列5所示。所述硫酯酶基因可通過質粒導入所述出發菌。所述質粒為pSPH09質粒或重組質粒pZ⑶01。所述重組質粒pZ⑶01具體為將質粒中大腸桿菌來源的硫酯酶基因(該硫酯酶如序列表的序列3所示，該硫酯酶基因具體如序列表的序列2所示)替換為編碼序列表的序列6所示蛋白質的DNA分子(具體為序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子)得到的重組質粒。所述重組質粒pZ⑶01具體為將質粒pSPH09的NdeI和EcoRI酶切位點之間的小片段替換為編碼序列表的序列6所示蛋白質的DNA分子(具體為序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子)得到的重組質粒。本專利技術還保護以上任一所述工程菌在生產3-羥基脂肪酸中的應用。所述3-羥基脂肪酸具體可為3-羥基癸酸(3HD )、3-羥基十二酸(3HDD )或3-羥基十四酸(3HTD )。 假單胞菌是生產中長鏈聚羥基脂肪酸酯的主要菌種。脂肪酸3 -氧化代謝循環是其獲得聚羥基脂肪酸酯合成前體3-羥基脂肪酸乙酰輔酶A (3-hydroxyacyl-CoA)的重要途徑。抑制或敲除產PHA菌中的與￠-氧化代謝途經相關基因可以提高PHA中特定單體組分的含量。3-hydroxyacyl - CoA本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種工程菌，是將出發菌進行如下（a）和（b）的改造得到的重組菌：（a）滅活PHA合成酶基因；（b）導入硫酯酶基因；所述出發菌為產聚羥基脂肪酸酯的細菌。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳國強，鄭美，曾國棟，
申請(專利權)人：清華大學，
類型：發明
國別省市：
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