本發明專利技術涉及一種木糖醇基因工程菌及其混合轉化生產木糖醇的方法，涉及生物技術領域。本發明專利技術提出構建一種木糖醇基因工程菌E.coliBL21-xdh06，該工程菌是通過PCR方法，從氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)獲得木糖醇脫氫酶（xylitoldehydrogenase，XDH）基因xdh，將其克隆并在宿主菌E.coliBL21進行穩定高效表達。該基因工程菌表達的木糖醇脫氫酶，其酶活性提高了10倍，利用該基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇，D-阿拉伯糖醇的轉化率由29%提高到91.6%。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，涉及一種木糖醇基因工程菌的構建及其用于混合轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法。
技術介紹
木糖醇是一種五碳糖，其化學名稱為1，2，3，4，5—戊醇，分子式為C5H12O5,是一種白色結晶或結晶性粉末，它的溶解度、溶液密度和折光系數等理化性質與蔗糖基本相同，可以作為蔗糖的替代品。木糖醇是一種具有較高營養價值的天然甜味物質，同時也是一種低能量甜味劑。木糖醇是人體糖類代謝的中間體，食用后不消耗胰島素，并且木糖醇具有特殊的防齲功能，可作糖尿病人的營養劑、治療劑及兒童防齲食品，同時木糖醇還具有降低血糖 濃度、促進鈣吸收等多種功能。目前，木糖醇工業生產主要采用化學酸化催化加氫法和利用微生物直接發酵半纖維素水解液生產木糖醇，這兩種方法的原料多來源于富含多縮戊糖的玉米芯、甘蔗渣等農副產品，這些原料首先經過高溫水解后成為含大量木糖的水解液，因此存在酸堿消耗高、環境污染嚴重、工藝復雜等問題。全生物法制備木糖醇的研究已經引起了全球的關注，但是在自然界中還沒有發現直接發酵葡萄糖生產木糖醇的微生物。1969年，Onishi和Suzuki首先報道了通過三步發酵將葡萄糖轉化為木糖醇，首先利用Ostnophilic將葡萄糖轉化為D-阿拉伯糖醇,再利用Acetic acid bacteria將生成的D-阿拉伯糖醇氧化成D-木酮糖，之后D-木酮糖被一種酵母還原為木糖醇，但是其轉化率非常低，后續發酵過程復雜。我們利用氧化葡糖桿菌{Gluconobacter oxydans)將D-阿拉伯糖醇氧化還原為木糖醇，氧化葡糖桿菌購自中國微生物菌種保藏中心，編號=CGMCCl. 110，該菌同時具有D-阿拉伯糖醇脫氫酶(AraDH)和木糖醇脫氫酶(XDH)活力，能夠將D-阿拉伯糖醇大部分氧化為木酮糖，而XDH的活力相對較低，木糖醇的生成量就遠遠小于D-木酮糖的量，如果以木糖醇為目的產物，如何提高XDH的活力成為研究的關鍵。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一株具有高木糖醇脫氫酶活力的基因工程菌大腸桿菌BL_xdh06 Escherichia coli BL_xdh06,已于2012年6月7日保藏于中國武漢的武漢大學的中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO. M 2012207。本專利技術的另一個目的是提供一種具有高轉化率的混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法。利用氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法，按照下述步驟進行(I)挑取氧化葡糖桿菌ifluconobacter斜面菌落于種子液培養基,28_37°C、100-260 rpm 振蕩培養 8-20h。(2)將種子液以體積比1-10 %的接種量接種到擴大培養基，28-37°C、100-260 rpm振蕩培養48-96h。(3)將(2)中的發酵液 6000-12000 rpm，4°C離心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH 6. 8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細胞轉化液重懸菌體； (4)轉化液轉化溫度為28-37 V，100-260rpm振蕩轉化24_60h，4h取樣，4h取樣，轉化液中得到木糖醇。本專利技術的另一個目的是提供一種具有高轉化率的混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法。利用構建的基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇，D-阿拉伯糖醇的轉化率由29 %提高到91. 6 %。利用上述構建的基因工程菌和氧化葡糖桿菌混合靜止轉化D-阿拉伯糖醇生產木糖醇的方法，按照下述步驟進行 (I)挑取氧化葡糖桿菌ifluconobacter斜面菌落于種子液培養基,28_37°C、100-260 rpm 振蕩培養 8-20h。 (2)將種子液以體積比1-10 %的接種量接種到擴大培養基，28-37°C、100-260 rpm振蕩培養48-96h。(3)將(2)中的發酵液 6000-12000 rpm，4°C離心 5-20 min，收集菌泥，用 O. I mol/L pH 6. 8的磷酸鉀緩沖液洗滌，離心后用適量的細胞轉化液重懸菌體； (4)將上述基因工程菌疋coli WJl\-xdh06接種于LB-Amp (LB-氨芐青霉素)培養基中，37 1振蕩培養過夜，次日以1-10 %的接種量將種子液轉接至新鮮LB-Amp培養基中，37°C培養至菌體光密度值約為O. 6-0. 8時，加入IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)至終濃度O. 5-1. 2mmol/L進行誘導表達5_15h左右。取一定體積工程菌液6000-12000 rpm,4°C離心5-20 min，收集菌泥，用O. I mol/L pH 6. 8的磷酸鉀緩沖液洗滌，菌體待用。(5)將(3)和(4)離心得到得菌體用適量的細胞轉化液重懸菌體。(6)轉化液轉化溫度為28-37 °C，100_260rpm振蕩轉化24_60h，4h取樣，轉化液中得到木糖醇。其中步驟(I)所述的種子液培養基組成如下葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L;氧化葡糖桿菌斜面培養基葡萄糖20-40. O g/L，胰蛋白胨1-10.0 8/1，酵母膏2-20.0 g/L，瓊脂 10-20 g/L，其余為水。其中步驟(2)所述的擴大培養基組成如下葡萄糖20-40.0 g/L，酵母膏2-20.0g/L，胰蛋白胨1-10.0 g/L，D-阿拉伯糖醇5-20.0 g/L，碳酸鈣10-20.0 g/L，其余為水。其中步驟(3)所述的細胞轉化液組成如下D_阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸鈣10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余為水。其中步驟(4)所述的LB-Amp培養基組成如下胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L, Amp (氨芐青霉素)50 μ g/L (終濃度)，其余為水。其中步驟(5)所述的細胞轉化液包組成如下D_阿拉伯糖醇20-40. O g/L，碳酸鈣10-30. O g/L，乙醇 3-8% (V/V)，其余為水。具體實施例方式本專利技術的氧化葡糖桿菌{Gluconobacter oxydans)購自中國微生物菌種保藏中心編號CGMCC1. 110。本專利技術所述木糖醇脫氫酶基因為Christina Prus報道的序列GVatereBiotechnology 23(2)，195 - 200，2005，NC_006677. I)。通過常規的基因工程技術將木糖醇脫氫酶基因導入大腸桿菌得到含有所述木糖醇脫氫酶基因Ui*)的大腸桿菌。本專利技術的基因工程菌具有較高的木糖醇脫氫酶酶活力，酶活力達21U/mg，其酶活性提高了 10倍。包括以下步驟 I、培養氧化葡糖桿菌，提取菌株的總DNA，通過PCR擴增出目的片段。2、目的片段和表達載體通過酶切用T4連接酶連接構建重組質粒，將重組質粒導入宿主菌萬.BL21 ο3、提取大腸桿菌質粒，通過PCR、雙酶切和SDS-PAGE進行表達驗證，證明重組菌構建成功。4、測定基因工程菌的木糖醇脫氫酶酶活力。具體過程見實施例I。實施例I、具有木糖醇脫氧聞酶活力的基因工程菌的獲得 根據NCBI上發表氧化葡糖桿菌的木糖醇脫氫酶基因序列和表達本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種木糖醇基因工程菌大腸桿菌BL？xdh06？？Escherichia？coli？BL？xdh06，保藏編號為CCTCC？NO.？M？2012207。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：齊向輝，郭齊，王飛，鄧文穎，王亮，孫文敬，陳華友，蒙健宗，張云光，
申請(專利權)人：江蘇大學，
類型：發明
國別省市：
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