一株大腸埃希氏菌LL016及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一株大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）LL016，其保藏號為CCTCC?NO：M?2012429。本發明專利技術還公開了上述大腸埃希氏菌LL016在利用合成培養基純厭氧發酵生產丁二酸中的應用以及方法。該菌株可以在厭氧條件下，利用無機氮源和葡萄糖生長，并大量積累丁二酸，菌株LL016生長速率較快，且產酸量較高，具有重大的社會意義和經濟價值。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一株大腸埃希氏菌LL016及其應用，特別涉及一株能夠利用合成培養基純厭氧發酵生產丁二酸的大腸埃希氏菌LL016及其應用，屬于工業微生物育種及其發酵

技術介紹
丁二酸，又名琥珀酸，是一種常見的天然有機酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中。丁二酸作為TCA循環的中間產物以及厭氧代謝的終端還原產物之一，在生物代謝過程中占有非常重要的地位。近年來的研究結果表明丁二酸還可以作為C4平臺化合物合成1，4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內酯等大宗化學品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解聚酯。近年來，隨著化石資源的日益枯竭和環境問題的日益嚴重，采用生物法制備丁二酸備受矚目，美國能源部將丁二酸列為未來12種最有價值的生物煉制產品之一。相對于化學合成法，生物合成制備丁二酸的方法受到越來越多的關注。生物合成丁二酸，是利用細菌，真菌等各種微生物，以葡萄糖或其他各種水解液為碳源，經微生物發酵生產丁二酸，相對于化學合成的方法，其一大優勢是原材料為廉價的生物質資源，利用生物法合成丁二酸成為近年來研究的熱點。發酵菌株是丁二酸生物合成的關鍵點之一，多數細菌和真菌都能產生丁二酸，但是只有部分菌株可產生高濃度的丁二酸，丁二酸工業生產菌包括一些丙酸鹽生產菌、典型的胃腸細菌以及瘤胃細菌。目前，丁二酸工業發酵菌株的研究主要集中在產丁二酸厭氧螺菌(,AnaerobiospiriIlum succiniciproducens),產丁二酸放線桿菌(Actinobacillus ■swcciflogefles),谷氛酸棒桿菌(Corynebacterium glutam ica )和大腸桿菌{Escherichia col )等。哀中Escherichia coli由于遺傳背景清楚,基因操作簡單,生長速度快,易調控以及所用培養基較為廉價，近年來成為生物法制備丁二酸的研究熱點。提高丁二酸的發酵產酸能力有很多的方法，尤其在發酵調控的手段上，很多的科研工作者都進行了深入的研究。G. N. Vemuri等人報道利用大腸桿菌兩階段發酵產丁二酸的方法，原理是有氧階段使菌體得到快速積累，然后轉為厭氧使菌體產生大量的丁二酸。由于兩階段發酵的局限性以及復雜性，最近一步厭氧發酵產丁二酸受到越來越多的關注。然而純厭氧條件下，大腸桿菌利用合成培養基生長并積累丁二酸的研究卻鮮有報道。可見，通過改良菌株，使其可以在純厭氧條件下利用合成培養基快速生長并大量積累產酸，在今后的丁二酸生長工業中具有舉足輕重的作用。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一株大腸埃希氏菌，能夠在厭氧條件下利用合成培養基生長，并且可以積累丁二酸。本專利技術的另一目的是提供上述大腸埃希氏菌在利用合成培養基純厭氧發酵生產丁二酸中的應用。本專利技術的第三個目的是提供上述大腸埃希氏菌利用合成培養基純厭氧發酵生產丁二酸的方法。為了解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案如下一、一株大腸埃希氏菌co7i ) LL016，其保藏號為 CCTCC NO M 2012429。本專利技術的大腸埃希氏菌co7i)LL016是將大腸桿菌的出發菌株大腸埃希氏菌coli) BAO16 (CCTCC NO M 2012350)經等離子體誘變后，利用合成培養基平板篩選得到能夠在厭氧條件下生長的菌株，在經過厭氧搖瓶發酵篩選獲得可以高產丁二酸的菌株為目標菌株。其具體步驟如下(1)等離子誘變將大腸桿菌原始菌株在試管中活化，37°c，200r/min，過夜培養。得到的菌液用無菌生理鹽水稀釋至OD6tltl=L 0，滴加在無菌載片上，用無菌風吹干；以氦氣為放電氣體，以80 120 W為射頻功率，以10 30 SLM作為氣體流量，以10 30 s為輻照時間， 對菌株進行等尚子體誘變；(2)合成培養基平板初篩將誘變后的載片置于裝有ImL的生理鹽水的具塞試管中， 劇烈震蕩，將載片上的菌液洗脫，稀釋成不同的濃度涂布于合成培養基平板上，37°C厭氧培養24 h。挑選生長較大，較為飽滿的菌落；(3)合成培養基平板復篩將步驟(2)中篩選到的菌株在合成培養基上反復轉點培養， 37°C厭氧培養24 h，挑選生長較大，較為飽滿的菌落；(4)厭氧搖瓶發酵篩選將步驟(3)中篩選出的菌株接種到種子培養基中擴大培養， 37°C, 200 r/min，培養48 h，然后在發酵培養基中發酵，接種量為2% (v/v)，30°C，170 r/ min，培養72 h ;考察步驟3)中篩選出的菌落中篩選出生長速度快，產酸量高的菌株。在上述篩選方法中，步驟(I)中所述的等離子體誘變方法中，選擇100 W為射頻功率，20 SLM為氣體流量，15 s為輻照時間。在上述篩選方法中，種子培養基為蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L, NaCl 5 g/L。發酵培養基為檸檬酸3 g · L—1，Na2HPO4 · 12H20 4 g · L—1，KH2PO4 8 g · L (NH4)2HPO4 8 g·!/1，NH4Cl O. 2 g · Γ1，(NH4)2SO4 O. 75 g · Γ1，MgSO4 · 7Η20 I g.L CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · Γ1，CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Γ1，H3BO3 O. 12 mg · Γ1，Al2(SO4)3 I. 77 mg ·] Na2MoO4 ·2Η20 0.5 mg.L—1，檸檬酸鐵 16. I mg.L—1，維生素 B1 20 mg .L—1，生物素 2 mg *L_ 堿式碳酸鎂16 g/L，葡萄糖20 g/L。固體平板培養基為:檸檬酸3 g · ΙΛ Na2HPO4 · 12Η20 4 g · Λ KH2PO4 8 g · Γ (NH4)2HPO4 8 g.L-1，NH4Cl O. 2 g · Γ1，(NH4)2SO4 O. 75 g · Γ1，MgSO4 · 7Η20 I g.L CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · Γ1，CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Γ1，H3BO3 O. 12 mg · Γ1，Al2(SO4)3 I. 77 mg ·] Na2MoO4 ·2Η20 0.5 mg.L—1，檸檬酸鐵 16. I mg.L—1，維生素 B1 20 mg .L—1，生物素 2 mg·] 瓊脂20 g/L，葡萄糖10 g/L。二、上述的大腸埃希氏菌{Escherichia coli) LLO16在利用合成培養基純厭氧發酵生產丁二酸中的應用。三、上述的大腸埃希氏菌{Escherichia coli) LLO16利用合成培養基純厭氧發酵生產丁二酸的方法，包含如下步驟(O平板培養將大腸埃希氏菌LL016接種在平板培養基上厭氧培養，培養溫度為 37 °C，培養時間為24 h ；(2)種子培養將平板培養的大腸埃希氏菌LL016接種到種子培養基中，充二氧化碳2 m本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一株大腸埃希氏菌（Escherichia？coli）LL016，其保藏號為CCTCC？NO：M？2012429。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：姜岷，梁麗亞，劉嶸明，萬青，陳旭，任心怡，馬江鋒，陳可泉，韋萍，歐陽平凱，
申請(專利權)人：南京工業大學，
類型：發明
國別省市：