【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程領域，特別涉及組織工程骨修復領域。
技術介紹
“靜電紡絲”一般簡稱為“靜電紡”、“電紡”。1934年，Formalas專利技術了用靜電力制備聚合物纖維的實驗裝置并申請了專利，其專利公布了聚合物溶液如何在電極間形成射流，這是首次詳細描述利用高壓靜電來制備纖維裝置的專利，被公認為是靜電紡絲技術制備纖維的開端。但是，從科學基礎來看，這一專利技術可視為靜電霧化或電噴的一種特例，其概念可以追溯到1745年。靜電霧化與靜電紡絲的最大區別在于二者采用的工作介質不同，靜電霧化采用的是低粘度的牛頓流體，而靜電紡絲采用的是較高粘度的非牛頓流體。所以，靜電紡絲是高分子流體靜電霧化的特殊形式，此時霧化分裂出的物質不是微小液滴，而是聚合物微小射流，可以運行相當長的距離，最終固化成纖維，原理圖詳見圖I。大段骨缺損的治療仍舊是骨科界的難題，當前此領域的研究多聚焦于骨替換材料·的改進、良好種子細胞的選擇及相應復合技術的開發，尚少關注在植入材料周圍包覆一層仿生骨膜，進而探討該仿生骨膜在植入體周圍微環境下的分子作用機制。靜電紡絲是制備納米纖維最重要且最簡單的方法，它的優勢是能高效率地獲得無紡布形式的電紡膜。目前，很多高分子物質已經通過靜電紡絲方法成功制備得到電紡膜，但是由于材料本身性能的局限性，限制了它們的應用。為了改善靜電紡絲材料的性能和拓寬應用范圍，特別是改善在生物材料中的應用性能。我們研究了將rFN/CDH融合蛋白包埋在殼聚糖中電紡制備雙層膜，外層為殼聚糖納米纖維膜，內層為包埋有rFN/CDH的殼聚糖納米纖維膜。殼聚糖是唯一的堿性天然多糖，是甲殼素脫以乙?；难?span style='display:none'>生物，分子鏈上具有眾多自由氨基，因而可形成聚陽離子電解質。殼聚糖有優良的生物相容性及抗菌、防腐、止血、促進傷口愈合、抑制潰瘍等功能，成膜性好，機械強度高，具有生物可降解性。rFN/⑶H(雙嗜性分子重組纖維連接蛋白/鈣粘附蛋白)是以FN和CDHll作為前體分子，通過基因拼接，融合得到的新型蛋白，它能夠顯著的增強骨髓間充質干細胞的黏附、增值和分化的能力。得到的復合納米纖維膜可用做仿生骨膜，增強骨損傷修復的效果。到目前為止尚未見報道用電紡技術制備rFN/CDH和殼聚糖雙層復合納米纖維方法。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供仿生骨膜的制備方法，該方法是利用靜電紡絲技術紡織仿生骨膜，為納米級紡絲構成的骨膜。本專利技術的另一目的在于提供仿生骨膜、仿生骨膜內膜的材料。該材料親和性高。能在預期的時間降解，利于釋放富集骨髓MSCs和成骨細胞的高分子蛋白。本專利技術還有一目的，在于提供所述方法制備的骨膜，該骨膜為納米級的，該骨膜除了高分子蛋白層之外，還包括保護層?；陟o電紡絲制備仿生骨膜的方法，具體包括以下步驟A內膜電紡液和外膜電紡液的制備將多糖基質的溶液和高分子蛋白混合并充分攪拌，得內膜電紡液；將所述多糖基質的溶液作外膜電紡液；B外膜電紡絲的制備應用靜電紡絲裝置將步驟A所得外膜電紡液在電壓為20_25kV、注射泵流速為O. 3-0. 5mL/小時、接收距離為10-15厘米條件下制備得到外膜電紡絲；C仿生骨膜的制備在步驟B所得的外膜電紡絲框架下，應用靜電紡絲裝置制備內膜電紡絲，內膜電紡絲的工藝參數是將步驟A所述外膜電紡液在電壓20-23kV、注射泵流速O. 3-0. 5ml/小時、接收距離10-20cm的條件下制備內膜電紡絲； 所述制備的內外兩層電紡膜，為仿生骨膜。優選的，步驟A中，所述高分子蛋白為骨形態發生蛋白、纖連蛋白和FN/CDH融合蛋白中的任一種或多種，它們對骨斷端處內源性骨髓的骨髓間充質干細胞(MSCs)募集、誘導礦化成骨能力。優選的，步驟A中，所述多糖基質的溶液為聚乙烯醇PVA、聚乳酸PLLA和殼聚糖中的任一種或多種，多糖基質對內層膜起保護和阻隔周圍環境不利骨質重建的干擾因素；骨膜外層用高分子量殼聚糖電紡納米纖維膜，內層用低分子量殼聚糖包埋高分子蛋白制備納米纖維膜。外層纖維膜降解吸收慢，利于保持膜的完整性，阻隔周圍肌肉組織中成纖維細胞等對成骨細胞礦化、骨痂形成的影響；內層膜降解快，利于釋放高分子蛋白，在仿生骨膜內層富集骨髓MSCs和成骨細胞等。進一步，步驟中所述內膜電紡液具體為所述質量體積分數為3%分子量為88000-102000的殼聚糖溶液和濃度為l-10mg/ml的rFN/CDH融合蛋白溶液以5 I體積比例混合；所述外膜電紡液為質量體積分數為2%分子量為240000-260000的殼聚糖溶液，所述rFN/⑶H融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO 1所示。進一步，步驟A中所述殼聚糖溶液具體為殼聚糖溶液是以水稀釋后的冰乙酸作為溶劑的。仿生骨膜內膜材料，所述仿生骨膜的內膜材料由氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示的rFN/⑶H融合蛋白包埋于多糖類基質中而成。進一步，所述多糖類基質為質量體積分數為3%分子量是88000-102000的殼聚糖溶液，所述rFN/CDH融合蛋白為濃度為l-10mg/ml的rFN/CDH融合蛋白溶液，所述多糖類基質與所述rFN/⑶H融合蛋白以5 I體積比例混合。由所述仿生骨膜內膜材料制備得到的仿生骨膜內膜。含所述的仿生骨膜內膜的仿生骨膜，所述仿生骨膜至少含有兩層，其中一層為仿生骨膜內膜，另一層為基于靜電紡絲制備的多糖類基質外膜。進一步，所述仿生骨膜為兩層。本專利技術的有益效果在于1)包覆在骨缺損修復材料周圍的仿生骨膜不但適合骨種子細胞在其表面增殖分化，還能募集骨傷環境中的MSCs、成骨細胞并使之駐留在仿生骨膜材料表面參與骨組織重建。2)本方法用殼聚糖等多糖基質作載體，靜電紡絲技術制備納米纖維雙層仿生骨膜，外層是高分子量純殼聚糖納米纖維膜，對內層膜起保護和阻隔周圍環境不利骨質重建的干擾因素；內層用共混紡方法把前期工作中獲得有效增強MSCs粘附、增殖效率和生長活力的融合蛋白rFN/CDH包埋在低分子量殼聚糖納米纖維中，隨著殼聚糖纖維降解吸收，膜材料表面暴露出融合蛋白rFN/CDH。附圖說明圖I為靜電紡絲技術的原理示意圖。圖2為仿生骨膜的使用示意圖。圖3為仿生骨膜的照片。 圖4為細胞在仿生骨膜上生長的照片。具體實施方式 所舉實施例是為了更好地對本專利技術的內容進行說明，但并不是本專利技術的內容僅限于所舉實施例。所以熟悉本領域的技術人員根據上述
技術實現思路
對實施方案進行非本質的改進和調整，仍屬于本專利技術的保護范圍。骨膜是骨表面除關節外所被覆的堅固的結締組織包膜。在骨端和肌腱附著部位，非常致密地附著在骨上。其它部位的骨膜厚，容易從骨上剝離。骨膜由兩部分構成，外層由膠原纖維緊密結合而成，富有血管、神經，有營養和感覺作用。內層也稱形成層，膠原纖維較粗，并含有細胞。生長中的骨膜，在其內面有成骨細胞整齊排列，具有造骨細胞的功能，參與骨的增粗生長，對骨的生長(長長，長粗)和增生(斷裂愈合)有重要作用。在老化的骨膜內細胞數減少，也不具備造骨細胞的機能，但在骨的再生過程中可恢復造骨能力，從骨膜向骨組織中進入的粗大纖維稱為夏貝氏纖維(Sharpey' s fiber) 0在肌肉、腱的附著部位纖維多，可以深入到骨組織中，但在其它部位，夏貝氏纖維數少。代替骨的骨膜系由軟骨膜變化而來。內有神經和血管為骨組織提供營養。rFN/⑶H融合蛋白的制備詳見申請號為200910103100. 6，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
基于靜電紡絲制備仿生骨膜的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：A內膜電紡液和外膜電紡液的制備將多糖基質的溶液和高分子蛋白混合并充分攪拌，得內膜電紡液；將所述多糖基質的溶液作外膜電紡液；B外膜電紡絲的制備應用靜電紡絲裝置將步驟A所得外膜電紡液在電壓為20?25kV、注射泵流速為0.3?0.5mL/小時、接收距離為10?15厘米條件下制備得到外膜電紡絲；C仿生骨膜的制備在步驟B所得的外膜電紡絲框架下，應用靜電紡絲裝置制備內膜電紡絲，內膜電紡絲的工藝參數是：將步驟A所述外膜電紡液在電壓20?23kV、注射泵流速0.3?0.5ml/小時、接收距離10?20cm的條件下制備內膜電紡絲；所述制備的內外兩層電紡膜，為仿生骨膜。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李振聲，董世武，楊曉占，郭洪峰，張瑗，楊小超，孫麗麗，莫增，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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