本發明專利技術提供了一種利用生物反應器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法，其是利用生物反應器和Cytodex-1微載體系統，用抗原性好的P3株乙腦病毒，對乙腦病毒P3株適應的高密度Vero細胞進行病毒感染，根據乙腦病毒P3株在Vero細胞上的增殖情況，待細胞病變達一定程度后收獲病毒液，使傳統病毒滴度從105-6PFU/ml提高到107-8PFU/ml以上，病毒含量提高10倍以上。將收獲的病毒液滅活后，加入佐劑定量分裝即可獲得高質量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生產工藝穩定，質量可控。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種疫苗的制備方法，具體地說，涉及一種。
技術介紹
豬乙型腦炎又稱日本乙型腦炎，是一種由日本乙型腦炎病毒引起的蚊媒性人畜共患病毒性傳染病。主要通過吸血昆蟲(主要為蚊子)叮咬，以豬-蚊-豬循環擴大病毒的傳播，使其成為乙型腦炎病毒的主要增殖宿主和傳染源。各種年齡、品種、性別的豬均易感染此病，患病種豬可垂直傳播傳給仔豬。該病夏秋季節流行，南方6 7月，東北8 9月達到高峰。在我國規模型養豬場中廣泛存在，呈地方性流行，北京、云南、湖南、湖北、福建、廣東、廣西、山西、山東、吉林、甘肅、河北等省份均報道從豬體內或蚊體內分離到乙型腦炎病毒。豬乙型腦炎無特效治療藥，最主要的防治措施為免疫接種。目前乙腦疫苗主要有三種日本的鼠腦純化疫苗、中國的SA14-14-2株減毒活疫苗及滅活疫苗。乙腦組織滅活苗雖然安全可靠，但生產成本高，存在大量無關抗原成分，副作用明顯。弱毒疫苗雖然保護性好，但可能出現潛在的毒力返強、帶毒、排毒、垂直傳播等不安全因素，而利用原代地鼠腎細胞生產乙型腦炎滅活疫苗的工藝，很難提高抗原含量和控制疫苗質量，因此，尋找一種安全、有效的乙腦滅活疫苗的生產方法成為亟待解決的問題。
技術實現思路
本專利技術旨在克服已有的豬乙腦滅活疫苗制備方法中存在的不足，提供一種新型的、安全、有效的豬乙腦滅活疫苗的制備方法。為了實現本專利技術目的，本專利技術的一種，其是利用生物反應器和Cytodex-I微載體系統，用乙腦病毒P3株對密度可達I 7 X 106/ml的乙腦病毒P3株適應的Vero細胞進行病毒感染，培養條件為34 ± 2°C，pH值7 8，待細胞病變達到75%以上時，收獲含有乙腦病毒的培養液，然后對收獲的病毒培養液進行滅活。其中，乙腦病毒P3株對Vero細胞進行病毒感染的接種比例為O. 005 O. 5M. O. I。優選地，使用β_丙內酯滅活病毒，使用量為β_丙內酯病毒液(V : V)=O. 1-2 4000，更優選地，β-丙內酯病毒液(V : V) = I : 4000。前述的方法，其還包括最后向病毒滅活液中加入氫氧化鋁膠和硫柳汞的步驟。優選地，氫氧化招膠和硫柳萊的終濃度分別為O. 6-1. 2mg/ml和O. lmg/ml。借由上述技術方案，本專利技術至少具有下列優點及有益效果本專利技術利用生物反應器和Cytodex-I微載體系統，用抗原性好的P3株乙腦病毒，對乙腦病毒P3株適應的高密度Vero細胞進行病毒感染，根據乙腦病毒P3株在Vero細胞上的增殖情況，待細胞病變達一定程度后收獲病毒液，使傳統病毒含量從105_6PFU/ml提高到107_8PFU/ml以上，病毒含量提高10倍以上。將收獲的病毒液滅活后，加入佐劑定量分裝即可獲得高質量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生產工藝穩定，質量可控。另外，與傳統生產工藝相比，本專利技術改進了培養系統的氧傳遞方式，減少了剪切力，降低有害代謝廢物濃度。由于可模擬空間中的微重力環境，使培養物的重力向量在旋轉過程中產生隨機化，導致一定程度的重力降低，使細胞處于一種模擬自由落體狀態，以此模擬微重力環境。由于沒有攪拌剪切力影響，細胞可以在相對溫和的環境中進行三維生長，同時在動物細胞培養過程中，葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關。通過控制葡萄糖和谷氨酰胺濃度可控制乳酸和氨等有害代謝物的產生濃度，可有效控制細胞生長狀況。大規模連續灌流培養高密度宿主細胞，細胞密度可達7X106/ml，這種成本低、易于操作的細胞能量代謝轉移研究方法，為實現高密度、高產率的細胞培養優化工藝提供了廣闊的應用前景。附圖說明圖I為本專利技術方法制得的豬乙型腦炎滅活疫苗的動物學免疫實驗結果。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。以下實施例中使用的非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)購自ATCC, Cytodex-I微載體系統購自Amersham公司，乙腦病毒P3株購自中國藥品生物制品檢定所。實施例I乙腦病毒P3株適應的VeiO細胞傳代擴增培養將乙腦病毒M53代P3株乙型腦炎病毒種子用標準MEM培養基稀釋后，腦內接種乳鼠，采集死亡小鼠腦組織，研磨制成腦組織懸液，離心，取上清制成乙型腦炎鼠腦病毒。將制備成的乙型腦炎病毒鼠腦懸液用細胞維持液進行適當稀釋后，接種長成單層的Vero細胞，在34. 0±2. (TC進行病毒培養，培養至細胞病變達75%左右時收獲病毒上清液，按照上述方法，將P3株乙型腦炎病毒在Vero細胞中連續傳代，測定病毒含量在107 0PFU/ml以上。表明乙腦病毒P3株對Vero細胞敏感，可以用于疫苗的生產。實施例2利用生物反應器和Cytodex-I微載體系統進行Vero細胞培養生物反應器工作體積IOL 500L，Cytodex-I微載體系統使用10g/L，細胞密度由5 X IO5 遞增至Ij 5 7 X IO6。實施例3接種乙腦病毒P3株對Vero細胞進行病毒感染當細胞長成單層時，按照接種O. 005 O. 5M. O. I進行P3株乙腦病毒感染，根據測定培養基(含有5-10%牛血清的標準MEM培養基)中葡萄糖濃度、乳酸鹽濃度、谷氨酰胺、耗氧速率以及PH值指標來控制；病毒培養溫度控制在34. O±2. 0°C，pH值為7 8，20 60轉/分，溶氧10 100%。實施例4病毒液的超濾濃縮、滅活及疫苗成品的制備接種病毒后，待細胞病變達到75%以上時收獲含有乙腦病毒的培養液，按O.l-2ml/4000ml病毒液的量加入β -丙內酯進行滅活。然后，向病毒滅活液中加入終濃度為O. 6-1. 2mg/ml氫氧化鋁膠和O. lmg/ml硫柳汞，充分搖勻，經灌裝后即為豬乙型腦炎滅活疫苗成品。實施例5豬乙型腦炎滅活疫苗的制備I病毒與細胞用于制備豬乙型腦炎滅活疫苗的病毒株為具有良好抗原性的乙腦病毒P3株，以對該病毒株具有良好敏感性的細胞系Vero細胞，作為制苗用細胞系，以感染并大量繁殖乙腦病毒。2毒種制備將制備疫苗用的細胞系Vero細胞接種到含5_10%新生牛血清的標準MEM培養基中，Cytodex I微載體濃度為10g/L，在溫度:37. 0 + 2. 0°C，pH值7-8，攪拌速度20-60轉/分條件下培養。待微載體上的Veix)細胞長成單層，棄去生長液，按O. 1%的比例接種基礎毒種，在34. 0±2. (TC條件下進行培養，待細胞病變達到75%以上收獲上清液。按照上述方法，病毒在細胞上連續傳代，測定病毒含量在107_°PFU/ml以上，表明病毒適應Vero細胞，即完成乙腦病毒適應Veix)細胞的傳代，可用于建立病毒基礎毒種和生產毒種。3連續的細胞培養Vero細胞接種到裝有濃度為10g/L的Cytodex I微載體的IOL生物反應器中，采用含有10%牛血清的標準MEM培養基培養，溫度37. O±2. 0°C，pH值7_8，溶氧40-70%，攪拌速度20-60轉/分。連接程序控制軟件，通過計算機在線監控。根據細胞生長情況使用含10%牛血清的標準MEM培養基進行灌流培養。4收獲感染病毒待微載體上的VeiO細胞長成單層，棄去生長液，接種O. 5M. O. I (感染復數)的生產用毒種，采用含有2-5%牛血清的標準MEM培養基，于34. O±2. (TC，pH為7_8，溶氧50-70%，攪拌速度20-60轉/本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用生物反應器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法，其特征在于，其是利用生物反應器和Cytodex?1微載體系統，用乙腦病毒P3株對連續灌流式培養的密度為1～7×106/ml的乙腦病毒P3株適應的Vero細胞進行病毒感染，培養條件為34±2℃，pH值7～8，待細胞病變達到75％以上時，收獲含有乙腦病毒的培養液，然后對收獲的病毒培養液進行病毒滅活。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：岳雷，郭鑫，陳靜，李淑芬，韓中山，張振山，
申請(專利權)人：唐山怡安生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：
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