一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗及制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗及制備方法，豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗是一種基因重組融合多肽，該多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列；用基因重組技術(shù)將M基因與免疫共刺激分子CD40配體(CD40L)連接成重組融合蛋白，并將融合基因克隆到原核表達(dá)載體pET-30a(+)中，IPTG誘導(dǎo)并表達(dá)重組融合蛋白，通過包涵體純化重組蛋白。本發(fā)明專利技術(shù)的有益效果為：重組融合蛋白可用于PRRSV感染的預(yù)防及治療。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥基因重組領(lǐng)域，具體涉及一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗及制備方法。
技術(shù)介紹
M蛋白是PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中最保守的蛋白，它有一個短肽段(18aa)暴露于病毒粒子表面，可能與病毒的聚集和結(jié)合有關(guān)。M蛋白聚集于粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并與GP5形成異源二聚體，在病毒對肺泡巨噬細(xì)胞附著和病毒侵染過程中起重要作用。M蛋白具有很強(qiáng)的免 疫原性，感染后IOd即可激發(fā)產(chǎn)生可檢測的抗體應(yīng)答，表達(dá)的重組M蛋白可以作為血清學(xué)試驗(yàn)的靶抗原和亞單位疫苗，M蛋自在細(xì)胞免疫中起重要作用。CD40L具有刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化。此外，它還作用于抗原呈遞細(xì)胞(APC)，促進(jìn)⑶28、B7-1和B7-2等免疫共刺激分子的表達(dá)，提高APC的抗原遞呈能力，增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗及制備方法，用于PRRSV感染的預(yù)防及治療。本專利技術(shù)的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與⑶40L融合疫苗，是一種基因重組融合多肽，該多肽含有PRRSV的M蛋白和⑶40L的主要氨基酸序列。上述豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與⑶40L融合疫苗的制備方法，包括以下步驟I)采用基因重組技術(shù)將PRRSV的M基因與⑶40L的cDNA基因連接形成融合基因；2)將融合基因克隆到原核表達(dá)載體pET30a的克隆位點(diǎn)上，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，液相色譜純化重組融合蛋白。本專利技術(shù)的有益效果為用重組融合蛋白的混合弗氏免疫佐劑皮下接種豬，檢測特異性IgG抗體和中和抗體滴度，驗(yàn)證重組融合蛋白的體液免疫水平；細(xì)胞免疫是抗細(xì)胞內(nèi)感染免疫的主要形式，此重組PRRSV疫苗通過將M蛋白與CD40L的融合，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗PRRSV的細(xì)胞免疫；免疫后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)可以有效地抑制PRRSV感染，降低受感染的豬的死亡率；此外，該融合蛋白抗原特異性高，不會引起非特異性免疫反應(yīng)，可作為預(yù)防和治療性疫苗在臨床的應(yīng)用。附圖說明圖I為本專利技術(shù)實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的M蛋白質(zhì)氨基酸序列；圖2為本專利技術(shù)實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的M基因核苷酸序列；圖3為本專利技術(shù)實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的CD40L蛋白質(zhì)氨基酸序列；圖4為本專利技術(shù)實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的CD40L基因核苷酸序列；圖5為本專利技術(shù)實(shí)施例所述的 一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的M-CD40L融合蛋白質(zhì)氨基酸序列；圖6為本專利技術(shù)實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗的M-⑶40L融合基因核苷酸序列。具體實(shí)施例方式本專利技術(shù)實(shí)施例所述的一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗，是一種基因重組融合多肽，該多肽含有PRRSV的M蛋白和⑶40L的主要氨基酸序列，所述M蛋白氨基酸序列如附圖I所示，所述CD40L的主要氨基酸序列如附圖3所示；M基因核苷酸序列如附圖2所示，CD40L基因核苷酸序列如附圖4所示，M-CD40L融合蛋白氨基酸序列如附圖5所示，M-⑶40L融合基因核苷酸序列如附圖6所示。實(shí)施例IM基因克隆到原核表達(dá)載體pET30aI、設(shè)計M基因引物參考PRRSV的M基因序列(GenBank號DQ379480)設(shè)計擴(kuò)增PRRSV病毒的M基因引物如下，引入酶切位點(diǎn)為EcoR I和Xho I (用斜體表示)M-F-E :GC GAATTC ATGGGGTCGTCCTTAGATGA,M-R-X GCTTATTTGGCATATTTGACAAG。2、提取 PRRS 病毒 RNAMarc-145 細(xì)胞感染 PRRSV 毒株為 VR2332，48 小時后(48hpi)，根據(jù) invitrogen 公司的RNA提取試劑盒，從感染病毒的Marc-145細(xì)胞中提取總RNA。3、PRRSV的M基因的反轉(zhuǎn)錄及PCR根據(jù)invitrogen公司的RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得M-mRNA的cDNA。然后根據(jù)上述弓I物為PCR擴(kuò)增M基因。PCR反應(yīng)條件如下94°C 4分鐘；94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒；共30循環(huán)；720C 10分鐘。結(jié)果得PCR產(chǎn)物約為525bp的目的片段。4、陽性重組質(zhì)粒pET30a_M的獲取I %瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的條帶，按下列體系用EcoR I和Xho I雙酶切回收PCR產(chǎn)物及載體pET30a質(zhì)粒本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與CD40L融合疫苗，是一種基因重組融合多肽，其特征在于：該多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列，所述M蛋白氨基酸序列如附圖1所示，所述CD40L的主要氨基酸序列如附圖3所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白與⑶40L融合疫苗，是一種基因重組融合多肽，其特征在于該多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列，所述M蛋白氨基酸序列如附圖I所示，所述CD40L的主要氨基酸序列如附圖3所示。2.權(quán)利要求I所述的豬繁殖與呼吸綜合...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李帥偉，龐程，
申請(專利權(quán))人：廣州格拉姆生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：