本發明專利技術涉及一種自造血干細胞中高效分化擴增CD4陽性T細胞的方法，該方法包括如下步驟：步驟a：收集血液血樣品，步驟b：分離血液樣品中單核細胞成分，步驟c：利用抗體富集單核細胞成分中的造血干細胞，步驟d：使用包含Notch-1的化學成分確定的CD4陽性細胞分化擴增培養基培養和擴增CD4陽性T細胞。本發明專利技術使用包含Notch-1的化學成分確定的培養系統在促進造血干細胞定向分化為CD4陽性T細胞的同時進行高效擴增，實現了該細胞的大量生產。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物
，一種使用化學成分確定的培養系統自造血干細胞中高效分化擴增⑶4陽性T細胞的方法。
技術介紹
T細胞是一群在細胞介導的免疫反應中有著重要作用的白細胞。研究表明，CD4陽性T細胞在艾滋病，癌癥以及自身免疫性疾病中有著重要的作用。在細胞核器官移植過程中，CD4細胞群往往會發生改變，造成免疫排斥，或是繼發性的免疫疾病。 實際上，之前人們為了治療癌癥已經克服細胞移植過程中造成的免疫異常和移植滯后現象，已經進行了防范的研究，包括體外增值CD4細胞群，來治療治病或扭轉體內免疫系統失衡。現在已經知道，體內絕大多數的T細胞是由骨髓造血干細胞在胸腺部位移植，經過胸腺的正向和反向選擇而最終形成具有功能的免疫細胞。在分化過程中，干細胞向T細胞分化的最初標志是⑶4抗原的表達。有研究已經仿照T細胞的發育模式，引入胸腺組織，來擴增CD4細胞群。然而，使用胸腺組織作為誘導擴增CD4細胞群必然面臨著來源稀少以及外來抗原的污染。造血干細胞是指生物體內能夠進行自我更新，并維持機體血液組織細胞新陳代謝的一群細胞。在生物體血液組織受到內源或外源性的損害時，干細胞可以被激活執行分化功能，有層次的生成紅細胞、白細胞和巨噬細胞等各種血液組織細胞，從而達到修復血液組織的目的.病人由于各種原因，實際上可能只是血液組織中某個組分丟失，比如艾滋病中CD4陽性細胞群丟失，所以成分輸血更具有針對性，也有更好的治療預期。骨髓當中含有豐富的造血干細胞，因此得到了最為廣泛和深入的研究。幾十年前，人們已經開始進行骨髓移植來治療白血病。骨髓移植的實質是造血干細胞的移植。研究證實，骨髓造血干細胞表達特定的表面抗原表型，比如，⑶133，⑶34等。實驗表明，給白血病實驗實驗小鼠模型僅僅移植一個造血干細胞，也可以完全重建血液組織。但是，盡管骨髓造血干細胞細胞較易分離和培養，但是，骨髓來源有限，難以滿足臨床大量的需求，而造血干細胞的提供者也必須承受額外的痛苦。臍帶血是指早產或正常分娩嬰兒臍帶內的血液。與骨髓相比，臍帶血來源充足，能夠保證臨床的大量需求。已經證實，臍帶血種含有活性很強的造血干細胞群。臍帶血中的造血干細胞與骨髓造血干細胞相似，有著相同的表面抗原表型，以及相似的分化能力。文獻表明，臍帶血造血干細胞有著更原始的干細胞特性和更低的免疫原性。應用臍帶血全血和造血干細胞移植治療血液系統疾病屢見報道。但是由于體外分化技術的不完善，自造血干細胞分化為CD4陽性細胞等特性細胞群后進行成分性輸血還鮮有報道。
技術實現思路
技術問題本專利技術的方法通過獲取血液樣品，在不需要滋養層的情況下，使用化學成分確定的培養基，實現對造血干細胞向CD4陽性T細胞的定向分化以及高效擴增。技術方案為解決上述技術問題，本專利技術提供的方案為自造血干細胞中高效分化擴增CD4陽性T細胞的方法，該方法包括如下步驟步驟a 收集血液血樣品，步驟b :分離血液樣品中單核細胞成分，·步驟c :利用抗體富集單核細胞成分中的造血干細胞，步驟d :使用包含Notch-I的化學成分確定的⑶4陽性細胞分化擴增培養基培養和擴增⑶4陽性T細胞。優選的，其特征在于，所述血液樣品是人的血樣品。優選的，其中所述血液樣品指新鮮采集或存貯的臍帶血、周邊血或骨髓。優選的，所述臍帶血血樣品均經過肝素抗凝，羥甲基纖維素裂解紅細胞，密度梯度離心獲取單核細胞成分之后進行接種。優選的，步驟c中，所述抗體為造血干細胞表面特征性抗原的抗體或抗體組合。優選的，其中所述之特征性抗原，指任何具有標志意義的造血干細胞表面抗原，包括⑶34，⑶133抗原。優選的，其中所述之特征性抗原組合，指具有標志意義的造血干細胞表面抗原組合，包括 CD34+/CD29+/CD3-/CD4-抗原組合。優選的,步驟d中,其中所述包含Notch-I的化學成分確定的⑶4陽性細胞分化擴增培養基包括基礎培養基；添加成分為血小板生成素(Thr0mb0p0ietinTPO)，N0th-l，和Flk_2/Flt3 ligand(FL), and 1% 牛血清白蛋白(BSA)。優選的，步驟b中，所述分離的方法，包括磁珠或流式細胞儀。有益效果本專利技術使用了成分確定的培養基對造血干細胞進行向CD4陽性細胞群的分化，同時實現了大量擴增。CD4陽性細胞分化擴增培養基各種化學成分確定，大大降低了培養過程中引入外來抗原的影響，對生產出的CD4陽性細胞進行質量控制提供了有效保證。在此環境下，生產出大量均一的⑶4陽性細胞群，實現了本專利技術。附圖說明圖I :臍帶血造血干細胞向⑶4陽性細胞群分化擴增過程中細胞生長方式。具體實施例方式下面結合附圖，對本專利技術做進一步說明。本專利技術涉及自造血干細胞通過定向分化和高效擴增獲取⑶4陽性T細胞的方法。CD4陽性T細胞在一些與免疫相關聯的疾病比如艾滋病，腫瘤和自身免疫性疾病中有著重要的功能。現已正實，在輸血過程中可以造成CD4陽性細胞種群的減少，從而引起相關的病癥。人們已經試圖在體外擴增CD4陽性T細胞，但是仍有許多缺陷，比如，分化效率以及擴增效率不足，以及，在培養擴增過程中引入組織成分作為滋養層。后者顯然存在著擴增方法繁瑣，不利于進行大量擴增。在培養過程中，引入組織成分，容易造成污染以及物種間的污染。因此如何簡便高效的擴增CD4陽性T細胞成為了阻礙其向臨場轉化的難題。本專利技術包括在不使用滋養層的培養體系中，使用包含Notch-I的化學成分確定的培養系統在促進造血干細胞定向分化為CD4陽性T細胞的同時進行高效擴增，實現了該細胞的大量生產。本專利技術的方法通過獲取血液樣品，在不需要滋養層的情況下，使用化學成分確定的培養基，實現對造血干細胞向CD4陽性T細胞的定向分化以及高效擴增。本專利技術所述的分離、分化和擴增造血干細胞的主要步驟如下在無菌條件下獲取血液樣品，25_200ml，肝素抗凝。造血干細胞的分離純化過程在獲取樣品后后24小時內進行。首先，使用同體積MDM稀釋抗凝過的血液，與5g/L的甲基纖維素按4:1混合，靜置30分鐘，沉降紅細胞。吸取上清，離心后，用PBS制成單細胞懸液，疊加到相對密度I. 077的淋巴細胞分離液上，2500rpm離心20min，取界面層，加PBS制成單核細胞懸液，離心洗滌。富集單核細胞群中的造血干細胞。造血干細胞在以MDM為基礎的培養基中培養，該培養基中還含有 Thrombopoietin (TPO)、Notch-l、Flk_2/Flt3 ligand(FL)和 BSA 等添加成分。細胞在懸浮狀態下生長，每7天加一倍的新鮮培養基，維持細胞密度在106/ml —下。具體而言，為達到本專利技術所述目的，本專利技術首先富集血液樣品中造血干細胞，使用CD4陽性細胞分化擴增培養培養基將臍帶血造血干細胞向CD4陽性細胞群分化，并實現大量擴增。⑶4陽性細胞分化擴增培養培養基的成分包括Iscove’ smodified DulbeccoJ smedium(IMDM),血小板生成素(TPO), Notch-I 和 Flk_2/Flt31igand(FL),和牛血清白蛋白。本專利技術所述的分離、分化和擴增造血干細胞的主要步驟如下在無菌條件下獲取血液樣品，25_200ml，肝素抗凝。造血干細胞的分離純化過程在 獲取樣品后后24小時內進行。首先，使用同體積MDM稀釋抗凝過的血液，與5g/L本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種自造血干細胞中高效分化擴增CD4陽性T細胞的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：步驟a：收集血液血樣品，步驟b：分離血液樣品中單核細胞成分，步驟c：利用抗體富集單核細胞成分中的造血干細胞，步驟d：使用包含Notch?1的化學成分確定的CD4陽性細胞分化擴增培養基培養和擴增CD4陽性T細胞。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫博，肖忠黨，
申請(專利權)人：東南大學，
類型：發明
國別省市：
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