一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法技術

本發明專利技術公開了一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法，包括以下步驟：分離人間充質干細胞；然后在間充質干細胞中利用慢病毒穩定過表達NR2F2基因以及小RNA干擾技術下調NR2F2基因表達；間充質干細胞NR2F2基因過表達以及下調表達后3D細胞微球的培養；將人間充質干細胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯肽和2959光引發劑以及PBS混合制備生物墨水；使用生物打印機在生物打印紙上打印過表達NR2F2基因的3D水凝膠軟骨組織；在軟骨形成培養基及小鼠皮下培養3D水凝膠軟骨組織21天以形成關節軟骨組織。本發明專利技術操作簡便、可重復性強，能夠有效促進間充質干細胞軟骨組織分化，能夠為軟骨組織工程的科學研究以及軟骨損傷的臨床治療提供有益的參考。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物學和組織工程學
，具體涉及一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法。
技術介紹
為了維持3D打印精確的打印分辨率，在生物墨水中接種的細胞密度不宜過大，然而高密度細胞是組織工程中間充質干細胞生成細胞外基質的必要條件。間充質干細胞是具有多種功能的前體細胞，具有軟骨、成骨及脂肪分化的能力，同時還能分泌多種細胞因子，在細胞凋亡、分化及免疫反應中具有重要的調控作用。間充質干細胞易于分離和收集，在生物打印過程中應用廣泛。然而，在軟骨分化過程中間充質干細胞過度增生依然是無法攻克的難題。研究發現NR2F2在調控肌肉和脂肪功能中具有重要作用，且NR2F2的激活與間充質干細胞成成骨分化以及肌肉生成相關。進一步實驗發現NR2F2基因過低表達的內皮細胞有向間充質干細胞轉化的趨勢，然而NR2F2基因過高表達則呈現相反的結果。因此構建間充質干細胞NR2F2基因過高表達誘導軟骨分化具有可行性和應用前景。組織工程的出現為軟骨損傷的修復提供了一種新的、有效的治療手段。通過生物3D打印并種植人間充質干細胞體外誘導分化構建功能關節軟骨是一種極具科學研究和臨床治療意義的方法。同時，探討NR2F2在間充質干細胞二維培養、三維細胞球培養以及生物打印軟骨組織培養過程中對軟骨分化及生成的作用。而NR2F2介導間充質干細胞軟骨分化的機制可能與間充質干細胞缺氧通路有關。綜上所述，軟骨組織工程領域迫切需要開發一種新的構建功能軟骨的方法，在能夠有效達到促進軟骨組織分化生長目的的同時，還能有效緩解間充質干細胞過度增長的缺陷。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術的不足，現提供一種能夠極大促進間充質干細胞分化促進關節軟骨組織生長的方法。為解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案為：一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法，其創新點在于：包括以下步驟：a）分離人間充質干細胞，b）在間充質干細胞中利用慢病毒穩定過表達NR2F2基因以及小RNA干擾技術下調NR2F2基因表達，c）間充質干細胞NR2F2基因過表達以及下調表達后3D細胞微球的培養，d）將人間充質干細胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯肽和2959光引發劑以及PBS混合制備生物墨水，e）使用生物打印機在生物打印紙上打印過表達NR2F2基因的3D水凝膠軟骨組織，f）在軟骨形成培養基及小鼠皮下培養3D水凝膠軟骨組織21天以形成關節軟骨組織。進一步的，所述步驟a）中間充質干細胞來源于22歲男性骨髓捐獻者，所有實驗均使用第三代細胞。進一步的，所述步驟b）中使用轉染試劑將慢病毒pCDH-EF1-Nr2f2-T2A-GFP或pCDH-EF1-T2A-GFP序列與pCMV-VSVG及pCMV-dvpr共同轉入293FT細胞中擴增培養，2-3天后離心收集上清液，慢病毒使用濃度為10MOI同時給予2mg/mL嘌呤霉素，其中NR2F2基因過表達效率達到初始含量的40倍以上。進一步的，所述步驟b）小RNA干擾人骨髓間充質干細胞NR2F2基因的表達中使用的是脂質體轉染試劑及OMEM，RNA使用終濃度調整為10nM，其中作用時間為72小時，轉染效率達到80-90%。進一步的，所述步驟c）中分別將NR2F2基因過表達組及其對照組和NR2F2基因下調表達組及其對照組的間充質干細胞的細胞數目調整為5×105個，離心機300g離心5分鐘后繼續培養2-3天，待球型顆粒形成后轉移至低粘附的24孔板內繼續培養21天。進一步的，所述步驟d）中先取一定量的聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于PBS中形成終濃度為10%(w/v)的溶液，然后加入丙烯酸酯肽使終濃度為1mM，最后加入光引發劑2959并調整溶液濃度為0.05%(w/v)，然后過濾除菌，將培養狀態良好的NR2F2基因過表達人間充質干細胞以及對照組人間充質干細胞在以上溶液中混合均勻，并調整細胞密度為6×106cells/ml。進一步的，所述步驟e）中生物打印機在生物打印紙上打印構建NR2F2基因過表達的3D水凝膠軟骨組織的具體步驟包括：生物打印機打印前準備工作；將制備好的生物墨水裝入打印筆內并用錫箔紙包住；使用打印軟件設計目標模型及模型尺寸；在3D生物打印紙上層層打印以及同時光聚反應構建NR2F2基因過表達的3D水凝膠軟骨組織以及其對照組的3D水凝膠軟骨組織。進一步的，所述步驟f）中將NR2F2基因過表達的3D打印軟骨組織及其對照組的3D打印軟骨組織分別轉移24孔板，在體積為1ml和10ng/mLTGFβ的誘導培養基中繼續培養21天，培養溫度均為37℃，培養環境為含5%(v/v)CO2的濕潤空氣，每3天更換培養基一次，或者將NR2F2基因過表達的3D打印軟骨組織及其對照組3D打印軟骨組織分別植入小鼠皮下繼續培養21天。本專利技術的有益效果如下：本專利技術提供的一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法可靠、操作簡便、可重復性強，能夠有效促進間充質干細胞軟骨組織分化，能夠為軟骨組織工程的科學研究以及軟骨損傷的臨床治療提供有益的參考，為生物打印技術的臨床化提供有效的方法及技術支撐。附圖說明圖1為本專利技術一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法中由間充質干細胞NR2F2穩定過表達及干擾表達第7天及第21天后的情況。圖2為本專利技術一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法中由間充質干細胞第21天NR2F2過表達及干擾后細胞微球3D培養過程中軟骨分化及生成基因的表達情況。圖3為本專利技術一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法中由間充質干細胞第7天及21天NR2F2過表達及干擾后細胞微球3D培養過程中軟骨組織相關蛋白及DNA表達情況。圖4為本專利技術一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法中由間充質干細胞第21天NR2F2過表達后3D生物打印體內培養過程中新生軟骨組織生成情況。具體實施方式以下由特定的具體實施例說明本專利技術的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本專利技術的其他優點及功效。一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法，包括以下步驟：a）分離人間充質干細胞，b）在間充質干細胞中利用慢病毒穩定過表達NR2F2基因以及小RNA干擾技術下調NR2F2基因表達，c）間充質干細胞NR2F2基因過表達以及下調表達后3D細胞微球的培養，d）將人間充質干細胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯肽和2959光引發劑以及PBS混合制備生物墨水，e）使用生物打印機在生物打印紙上打印過表達NR2F2基因的3D水凝膠軟骨組織，f）在軟骨形成培養基及小鼠皮下培養3D水凝膠軟骨組織21天以形成關節軟骨組織。優選的，步驟a）中間充質干細胞來源于22歲男性骨髓捐獻者，所有實驗均使用第三代細胞。優選的，步驟b）中使用轉染試劑將慢病毒pCDH-EF1-Nr2f2-T2A-GFP或pCDH-EF1-T2A-GFP序列與pCMV-VSVG及pCMV-dvpr共同轉入293FT細胞中擴增培養，2-3天后離心收集上清液，慢病毒使用濃度為10MOI同時給予2mg/mL嘌呤霉素，其中NR2F2基因過表達效率達到初始含量的40倍以上。優選的，步驟b）小RNA干擾人骨髓間充質干細胞NR2F2基因的表達中使用的是脂質體轉染試劑及OMEM，RNA使用終濃度調整為10nM，其中作用時間為72小時，轉染效率達到80-90%。優選本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法，其特征在于：包括以下步驟：a）分離人間充質干細胞，b）在間充質干細胞中利用慢病毒穩定過表達NR2F2基因以及小RNA干擾技術下調NR2F2基因表達，c）間充質干細胞NR2F2基因過表達以及下調表達后3D細胞微球的培養，d）將人間充質干細胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯肽和2959光引發劑以及PBS混合制備生物墨水，e）使用生物打印機在生物打印紙上打印過表達NR2F2基因的3D水凝膠軟骨組織，f）在軟骨形成培養基及小鼠皮下培養3D水凝膠軟骨組織21天以形成關節軟骨組織。

【技術特征摘要】
1.一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法，其特征在于：包括以下步驟：a）分離人間充質干細胞，b）在間充質干細胞中利用慢病毒穩定過表達NR2F2基因以及小RNA干擾技術下調NR2F2基因表達，c）間充質干細胞NR2F2基因過表達以及下調表達后3D細胞微球的培養，d）將人間充質干細胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯肽和2959光引發劑以及PBS混合制備生物墨水，e）使用生物打印機在生物打印紙上打印過表達NR2F2基因的3D水凝膠軟骨組織，f）在軟骨形成培養基及小鼠皮下培養3D水凝膠軟骨組織21天以形成關節軟骨組織。2.根據權利要求1所述的一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法，其特征在于：所述步驟a）中間充質干細胞來源于22歲男性骨髓捐獻者，所有實驗均使用第三代細胞。3.根據權利要求1所述的一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法，其特征在于：所述步驟b）中使用轉染試劑將慢病毒pCDH-EF1-Nr2f2-T2A-GFP或pCDH-EF1-T2A-GFP序列與pCMV-VSVG及pCMV-dvpr共同轉入293FT細胞中擴增培養，2-3天后離心收集上清液，慢病毒使用濃度為10MOI同時給予2mg/mL嘌呤霉素，其中NR2F2基因過表達效率達到初始含量的40倍以上。4.根據權利要求1所述的一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法，其特征在于：所述步驟b）小RNA干擾人骨髓間充質干細胞NR2F2基因的表達中使用的是脂質體轉染試劑及OMEM，RNA使用終濃度調整為10nM，其中作用時間為72小時，轉染效率達到80-90%。5.根據權利要求1所述的一種促進間充質干細胞軟骨組織分化的方法，其特征在于：所述步驟c）中分別將NR2F2基因過表達組及其...

【專利技術屬性】
技術研發人員：崔曉峰，高桂芳，
申請(專利權)人：武漢楓霖科技有限公司，
類型：發明
國別省市：湖北;42