一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法技術

本發明專利技術公開基于生物3D打印構建皮膚組織的方法，步驟為：除脂，皮膚組織；采用酸酶結合法處理，取上清液；向粗提液中加入碳酸鉀、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀或硫酸鈉鹽析；將得到的膠原作為打印皮膚的墨水原料灌注于生物打印機的打印室中，打印室溫度控制在4

Method for constructing skin tissue based on biological 3D printing

The invention discloses a method to construct biological skin tissue based on 3D printing steps: grease, skin tissue; the acid treatment method to extract supernatant; adding potassium carbonate, sodium carbonate, sodium chloride, potassium chloride, potassium sulfate or sodium sulfate; the obtained collagen as printing room the ink perfusion of the skin to biological raw material print printer, print room temperature control in 4

【技術實現步驟摘要】
一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法
本專利技術屬于生物學和組織工程學
，具體涉及一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法。
技術介紹
皮膚是覆蓋于人體全身表面具有重要生理功能的器官，由表皮層和真皮層組成。一旦皮膚發生大面積創傷或缺失時，便會對人體造成致命的傷害。理想的修復、代替缺損的皮膚組織應當具備以下幾個特點：能夠有效覆蓋皮膚缺損創面；具備一定的機械強度；逐漸促進皮下細胞及血管生長，形成自體表皮層和真皮層結構且最大程度的生長至正常皮膚的愈合質量；經濟易得、使用簡便。隨著組織工程技術的快速發展，組織工程皮膚已成為皮膚缺損治療的熱點，早期的人造皮膚或皮膚替代產品也有很多，其技術中涉及的人造皮膚制備成本較為高昂，同時也增加了保證材料緊密結合的難度。因此，皮膚組織工程領域迫切需要開發一種新的促進皮膚修復的海綿材料的方法，在能夠有效達到促進皮膚修復目的同時還能有效緩解制備成本高及耗時長的缺陷。膠原是脊椎動物體內含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白，大量存在于骨、軟骨、肌腱及皮膚中，占人體或其他動物體總蛋白含量的25%-33%。其中I型膠原占生物體總膠原量的90%，因此I型膠原在生物材料中的使用也最為廣泛。豬皮來源的膠原海綿來源豐富經濟易得，提取率高，它與人體膠原蛋白結構相似，很適合人體器官的修復和再生。將這種生物3D打印的皮膚組織修復材料貼合至創傷處后纖維細胞和血管逐漸長入海綿層，2-3周后形成類似于皮膚的基質成分。因此可以有效誘導缺損組織處細胞的遷移、增殖和分化。利用膠原海綿結構的人造皮膚原位誘導缺損皮膚再生，可以大大的縮短傷口愈合周期。此外，還可以增強創面愈合后的皮膚彈性、柔韌性以及減少疤痕增生。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對現有技術的不足，現提供一種能夠極大促進皮膚修復的基于生物3D打印構建皮膚組織的方法。為解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案為：一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法，其創新點在于：包括以下步驟：（1）除脂，分離魚皮、軟骨、肌腱、牛蹄筋、豬蹄或皮膚組織；（2）采用酸酶結合法處理，加入胃蛋白酶消化抽提3天，取上清液；（3）向粗提液中加入碳酸鉀、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀或硫酸鈉鹽析；（4）將得到的膠原作為打印皮膚的墨水原料灌注于生物打印機的打印室中，打印室溫度控制在4oC；（5）通過層疊打印技術在溫度為37oC的熱臺上打印任意形狀和大小的皮膚；（6）將所打印的皮膚置于容器中冷凍干燥；（7）將凍干的皮膚組織置于甲醛或戊二醛中交聯6小時，并用磷酸鹽緩沖液或純水洗凈；（8）最后浸沒于乙醇水溶液中凍干保存。進一步的，所述步驟（1）中小心去除皮下脂肪，將組織剪成小塊，溫度控制于22-30oC，用純水洗滌，放于常溫下曬干后放置于4oC冷柜中備用。進一步的，所述步驟（2）中將組織浸泡于醋酸溶液中，抽提過程于4oC環境下進行，所述胃蛋白酶加入比例為10:1。進一步的，所述步驟（3）中將濾液充分攪拌至膠原完全沉淀析出，10000轉/分鐘離心15分鐘，收集沉淀。進一步的，所述步驟（4）中將膠原移至4oC打印室并混勻，消除氣泡。進一步的，所述步驟（5）中每層打印厚度為500微米，總共打印十層，總厚度5毫米，所述打印平臺的濕度為95%。進一步的，所述步驟（6）中將所打印皮膚組織迅速放置于-80oC下冷凍，然后將其轉入冷凍干燥機內凍干。進一步的，所述步驟（7）中將凍干的皮膚組織完全浸泡于交聯劑內，交聯后除去交聯劑，用磷酸鹽緩沖液或純水洗凈。進一步的，所述步驟（8）中小心將皮膚組織取出并浸泡于乙醇水溶液中，置于合適容器中繼續冷凍干燥。本專利技術的有益效果如下：本專利技術方法可靠、操作簡便、能夠有效促進皮膚修復，能夠為人造皮膚工程的科學研究以及皮膚損傷的臨床治療提供有益的參考，為治療皮膚創傷及燒傷等疾病提供臨床化的有效方法及技術支撐。附圖說明圖1為本專利技術一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法中所打印皮膚組織冷凍干燥后的形態；圖2為本專利技術一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法中由cck-8方法檢測膠原海綿生物相容性分析；圖3為本專利技術一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法中由cck-8方法檢測皮膚組織生物相容性分析；圖4為本專利技術一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法中由cck-8方法檢測打印皮膚對細胞生長的影響。具體實施方式以下由特定的具體實施例說明本專利技術的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本專利技術的其他優點及功效。一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法，包括以下步驟：（1）除脂，分離魚皮、軟骨、肌腱、牛蹄筋、豬蹄或皮膚組織；小心去除皮下脂肪，將組織剪成小塊，溫度控制于22-30oC，用純水洗滌，放于常溫下曬干后放置于4oC冷柜中備用。（2）采用酸酶結合法處理，加入胃蛋白酶消化抽提3天，取上清液；將組織浸泡于醋酸溶液中，抽提過程于4oC環境下進行，胃蛋白酶加入比例為10:1。（3）向粗提液中加入碳酸鉀、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀或硫酸鈉鹽析；將濾液充分攪拌至膠原完全沉淀析出，10000轉/分鐘離心15分鐘，收集沉淀。（4）將得到的膠原作為打印皮膚的墨水原料灌注于生物打印機的打印室中，打印室溫度控制在4oC；將膠原移至4oC打印室并混勻，消除氣泡。（5）通過層疊打印技術在溫度為37oC的熱臺上打印任意形狀和大小的皮膚；每層打印厚度為500微米，總共打印十層，總厚度5毫米，打印平臺的濕度為95%。（6）將所打印的皮膚置于容器中冷凍干燥；將所打印皮膚組織迅速放置于-80oC下冷凍，然后將其轉入冷凍干燥機內凍干。（7）將凍干的皮膚組織置于甲醛或戊二醛中交聯6小時，并用磷酸鹽緩沖液或純水洗凈；將凍干的皮膚組織完全浸泡于交聯劑內，交聯后除去交聯劑，用磷酸鹽緩沖液或純水洗凈。（8）最后浸沒于乙醇水溶液中凍干保存；小心將皮膚組織取出并浸泡于乙醇水溶液中，置于合適容器中繼續冷凍干燥。為了進一步了解本專利技術方法的效果，對所打印的皮膚組織進行了相應的鑒定。（1）cck-8細胞生物相容性檢測將皮膚組織充分溶解于pH=3的稀鹽酸中，按照比例分別配置1體積皮膚溶液與9體積的培養液以及2體積皮膚溶液與8體積的培養液，對照組同理采用上述體積比的稀鹽酸與培養液代替。將HUVEC細胞接種于96孔板內，細胞密度為8x104/mL，每孔加入100μL，待細胞生長至80%后換液，加入配好的皮膚溶液繼續培養24小時、48小時、72小時。吸去舊培養液加入配好的cck-8溶液100μL孵育2-3小時，將液體轉移至新96孔板中450nm波長下檢測吸光度值。（2）細胞在打印的皮膚組織上的3D培養將打印的皮膚組織剪成48孔大小并置于孔板底部，將300μLBMSCs細胞混懸液均勻加于海綿上，其中細胞密度為1x105/mL，每隔3天換液。置于培養箱內培養3天、14天后，分別吸去舊培養液并加入配好的cck-8溶液100μL孵育2-3小時，將液體轉移至新96孔板中450nm波長下檢測吸光度值。如圖1為本專利技術一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法中所打印皮膚組織冷凍干燥后的形態。如圖2為本專利技術一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法中由cck-8方法檢測膠原海綿生物相容性分析。1份皮膚組織與9份培養液混合均勻，分別檢測24小時、48小時、72小本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）除脂，分離魚皮、軟骨、肌腱、牛蹄筋、豬蹄或皮膚組織；（2）采用酸酶結合法處理，加入胃蛋白酶消化抽提3天，取上清液；（3）向粗提液中加入碳酸鉀、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀或硫酸鈉鹽析；（4）將得到的膠原作為打印皮膚的墨水原料灌注于生物打印機的打印室中，打印室溫度控制在4

【技術特征摘要】
1.一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）除脂，分離魚皮、軟骨、肌腱、牛蹄筋、豬蹄或皮膚組織；（2）采用酸酶結合法處理，加入胃蛋白酶消化抽提3天，取上清液；（3）向粗提液中加入碳酸鉀、碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀或硫酸鈉鹽析；（4）將得到的膠原作為打印皮膚的墨水原料灌注于生物打印機的打印室中，打印室溫度控制在4oC；（5）通過層疊打印技術在溫度為37oC的熱臺上打印任意形狀和大小的皮膚；（6）將所打印的皮膚置于容器中冷凍干燥；（7）將凍干的皮膚組織置于甲醛或戊二醛中交聯6小時，并用磷酸鹽緩沖液或純水洗凈；（8）最后浸沒于乙醇水溶液中凍干保存。2.根據權利要求1所述的一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法，其特征在于：所述步驟（1）中小心去除皮下脂肪，將組織剪成小塊，溫度控制于22-30oC，用純水洗滌，放于常溫下曬干后放置于4oC冷柜中備用。3.根據權利要求1所述的一種基于生物3D打印構建皮膚組織的方法，其特征在于：所述步驟（2）中將組織浸泡于醋酸溶液中，抽提過程于4oC環境下進行，所述胃蛋白酶加入比例為10:1。4....

【專利技術屬性】
技術研發人員：崔曉峰，高桂芳，
申請(專利權)人：武漢楓霖科技有限公司，
類型：發明
國別省市：湖北,42