一種以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞的擴增、凍存及復蘇方法技術

本發明專利技術公開了一種以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞的培養、冷凍及復蘇方法，可以解決患者為連續使用活化的CD3+CD8+為主的淋巴細胞而需多次采血的問題。其包括：（1）通過將外周血樣提取出的淋巴細胞與IL-2，IL-15，抗CD3抗體，抗CD28抗體接觸，以擴增活化的以CD3+CD?8+為主活化淋巴細胞；（2）活化淋巴細胞的凍存；（3）活化淋巴細胞的復蘇。本發明專利技術所培養的活化淋巴細胞成分清晰，CD4+CD25+Treg細胞含量極少，并含有大量的CD8+T淋巴細胞，可以根據病人其他治療如放療化療來調整活化淋巴細胞的回輸時間和次數，以更好的治療腫瘤，感染性疾病以及免疫缺陷癥等疾病。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及活化淋巴細胞的擴增、凍存以及復蘇方法，屬于生物

技術介紹
機體的免疫系統具有識別和殺傷腫瘤細胞的能力，已經獲得了大量研究數據的證實。近年來，腫瘤特異性細胞免疫治療在臨床實踐中顯示了非常令人興奮的療效。2002年，RosenbergSA等人在Science雜志報道了利用體外大量擴增的腫瘤特異性腫瘤浸潤淋巴細胞過繼回輸方法，他們在體外篩選出具有病人自身惡黑細胞特異性殺傷作用的腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)，大量擴增后回輸給自體病人。在這種方法中，經過體外IL-2和抗⑶3抗體 的聯合作用，數量高達1011的、腫瘤細胞高度特異的多種腫瘤抗原特異性識別的TILs被回輸至經清除淋巴細胞化療的病人體內，這些細胞以⑶3+⑶8+⑶56-的T細胞為主。在接受治療的13例病人中，6例病人完全緩解(CR，腫瘤完全消失)，4例病人部分緩解(PR，腫瘤消失50%以上,無新發腫瘤)。這10例病人均發生明顯的腫瘤縮小和/或消失。在Dr. Rosenberg的長期臨床實踐中，他們發現，利用來源于腫瘤的腫瘤浸潤淋巴細胞進行晚期惡性黑色素瘤的治療，其有效率可達50%以上。Greenberg和Yee C的研究組在利用具有腫瘤特異性殺傷能力的CD8+T細胞克隆進行的治療中發現，多次使用這類細胞、聯合使用化療藥或不使用化療藥進行晚期惡性黑色素瘤病人的治療，可以使部分病人腫瘤長期穩定、明顯延長病人生存期。然而，在這些特異性細胞免疫治療過程中，存在著特異性細胞培養擴增的技術難題。首先，對于腫瘤浸潤淋巴細胞來說，(I)需要解決腫瘤組織體外原代培養的技術難題，以鑒定所獲得的腫瘤浸潤淋巴細胞對自體腫瘤有殺傷能力；(2)對于生命關鍵性器官所發生的腫瘤，需要鑒定特異性浸潤T淋巴細胞所識別是否為組織相關性抗原，以避免自身免疫病的發生。所謂組織相關性抗原，指的是在腫瘤中高表達，在正常對應的組織器官中低表達的腫瘤抗原。在免疫治療黑色素瘤時，可能會發生白癜風的副作用，而對如肝、腦等生命重要器官，由于這類抗原誘導的特異性殺傷細胞所可能產生的自身免疫病，使腫瘤浸潤淋巴細胞進行特異性免疫治療的應用受到限制。其次，對于使用抗原和樹突狀細胞(DC)進行體外腫瘤抗原特異性的淋巴細胞克隆來講，(I)需要通過Ieukophresis獲取大量的外周血單個核細胞以獲得DC和飼養細胞；(2)每一個目的抗原均須進行體外抗原刺激，以獲得腫瘤特異性T細胞克隆，技術復雜、耗時長、細胞用量大，限制了多種抗原特異性T細胞的獲得。另外，活化的淋巴細胞需多次輸注才能達到較好的治療效果，多數醫療單位利用血細胞分離機采集單個核細胞，而這種采集方法價格昂貴，多次采集給患者帶來心理及身體的痛苦。如果一次采集的單個核細胞可以凍存，當患者治療需要時，復蘇并誘導為活化的淋巴細胞，就為患者節約了費用，減輕了痛苦。傳統的體外擴增淋巴細胞的方法，是以CD3抗體作為淋巴細胞激活劑，并采用大劑量的IL-2，這樣雖然在短期內得到大量活化的T細胞，但很容易導致活化誘導的細胞死亡，最終難以獲得足夠數量的細胞毒性T淋巴細胞，并且含有大量的⑶4+⑶25+Treg細胞(見具體實施方式14)。小劑量的抗⑶3單抗可以活化靜止的T細胞，誘導其產生殺傷腫瘤的作用，這種殺傷作用既包括對腫瘤細胞的直接殺傷，又包括分泌相關的細胞因子對腫瘤細胞產生間接殺傷，還可通過誘導腫瘤細胞發生凋亡對其產生作用。另一方面加入抗⑶3單抗后可以激活腫瘤細胞的凋亡途徑，導致凋亡細胞的數量增加，而這種凋亡作用主要通過Fas途徑產生。但大劑量加入CD3單抗進行培養時并未產生直線增加的殺傷和誘導作用，相反出現凋亡數量下降的現象，甚至出現對T細胞的抑制作用，壞死及凋亡細胞的數量均下降，這可能是因為T細胞受體(TCR)的數量有限，在過量的抗CD3單抗作用下，不但不能激活T細胞，反而會因受體表面被封閉而無法活化。
技術實現思路
為了解決了現有活化淋巴細胞制備(主要是指CIK細胞)純度低，增殖力低的缺 點。并解決病人因為多次使用細胞而需多次采血的問題。本專利技術聯和使用抗CD3單抗、抗CD28單抗、IL-2、IL-15等共同培養，另外通過免疫磁珠技術去除在培養過程中產生的CD4+CD25+Treg細胞，使得培養的細胞種類純度更高。本專利技術凍存以及復蘇的方法，可以解決患者為連續使用活化的⑶3+⑶8+為主的淋巴細胞而需多次采血的問題。我們在使用本專利技術所培養的活化的淋巴細胞治療的臨床觀察，在多名患者中，觀察到腫瘤的長期穩定、配合化療腫瘤的明顯縮小等現象。這種現象，與腫瘤特異性細胞免疫治療觀察到的效果類似。同時，活化的淋巴細胞群體中CD8+T淋巴細胞百分比越高，治療效果越好。因此，我們懷疑在這些“非特異性免疫細胞”中，可能存在腫瘤特異性CD8+殺傷性T淋巴細胞，發揮了其抗腫瘤效果。人體內T淋巴細胞包括許多針對不同抗原的特異性細胞，這些細胞經過培養后，理論上他們會針對不同的腫瘤抗原或病毒抗原具有廣泛的識別和殺傷效果。⑶28分子又稱TP44，是一種包括202個氨基酸的I型跨膜糖蛋白。可以提供T細胞活化所需的共刺激信號，促進T細胞活化增殖。利用CD28單抗作為CD28的配體，以CD3單抗激活TCR信號途徑，可有效地增強⑶3AK細胞的增殖活性，并延緩⑶3AK細胞的凋亡。⑶28共刺激使外周血淋巴細胞活化顯著促進細胞因子產生，⑶28單抗協同⑶3單抗可明顯提高外周血淋巴細胞上清中IFNy、IL-2、IL-4水平，并且CD28單抗能抑制IFNy、IL_2、腫瘤壞死因子(TNF)等的mRNA降解IL-2是主要由活化的T細胞分泌的重要的細胞生長因子。它最初是從絲裂原刺激的淋巴細胞的培養上清中純化出來的，是調節T淋巴細胞應答的一種重要的細胞因子。在抗原活化后，能促進T細胞的增值，但是在后期，隨著活化T細胞數量的增多和IL-2的濃度的逐漸升高，T細胞便很快地進入Fas/FasL介導的的活化誘導的細胞死亡(AICD)。，因此單純使用IL-2并不能是T細胞在體外較長時間的擴增IL-15也是一種重要的細胞生長因子，它主要由單核細胞和樹突狀細胞表達分泌，能夠促進NK細胞，T細胞和B細胞的增殖和分化。IL-15是由能夠刺激IL-2依賴的T細胞系的增殖，而且這種增殖效應不能被anti-IL-2抗體所阻斷。因此IL-15與IL-2具有相似的生物學效應，即兩者都能促進T細胞的分化增值，然而，與IL-2不同的是，IL-15受體結合后，能夠穩定rc鏈，且上調抗凋亡基因bcl-2，從而表現有抗AICD和延長細胞存活時間的作用。⑶4+⑶25+Treg細胞是自然產生并成熟于胸腺的獨特細胞群，占⑶4+T細胞5% —10%。它可通過細胞接觸依賴機制或抑制性細胞因子依賴機制主動抑制自身反應性T細胞的活化，維持自身免疫耐受，防止自身免疫病的發生。⑶4+⑶25+Treg細胞主要在機體免疫系統中發揮負向調節作用，既能抑制不恰當的免疫反應，又能限定免疫應答的范圍、程度及作用時間，對效應細胞的增殖、免疫活性的發揮起抑制作用。抑制性表現在Treg 細胞能夠抑制許多免疫細胞的活性、增殖及功能，如⑶4+Th細胞、⑶8+細胞毒性T細胞、⑶Id限制性NKT細胞、單核/巨噬細胞、初始/記憶B細胞和樹突狀細胞(DCs)等。經TcR介導的信號刺激可以是本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞的擴增方法，其特征是，（a）將外周血血樣中分離出的單個核細胞在含有淋巴細胞激活劑和細胞因子IL？2的培養基中培養；所述淋巴細胞激活劑為抗CD3抗體和抗CD28抗體，抗CD3抗體的終濃度為0.1？100ng/ml；抗CD28抗體的終濃度為0.1？50ng/ml；所述IL？2終濃度為100U/ml至5000U/ml；（b）將（a）步驟中培養得到的淋巴細胞用mini？MACS磁珠分選去除CD4+CD25+Treg細胞；（c）將（b）步驟中培養得到的淋巴細胞在含有細胞因子IL？2和IL？15的培養基中培養；所述IL？2終濃度為50？500U/ml，IL？15的終濃度為10？500ng/ml；（d）收集（c）步驟中得到的淋巴細胞用于回輸或凍存。

【技術特征摘要】
1.ー種以⑶3+⑶8+為主的活化淋巴細胞的擴增方法，其特征是， Ca)將外周血血樣中分離出的單個核細胞在含有淋巴細胞激活劑和細胞因子IL-2的培養基中培養；所述淋巴細胞激活劑為抗CD3抗體和抗CD28抗體，抗CD3抗體的終濃度為O. l-100ng/ml ;抗CD28抗體的終濃度為O.ト50ng/ml ;所述IL-2終濃度為100U/ml至5000U/ml ； (b)將(a)步驟中培養得到的淋巴細胞用miniMACS磁珠分選去除CD4+CD25+Treg細胞； (c)將(b)步驟中培養得到的淋巴細胞在含有細胞因子IL-2和IL-15的培養基中培養；所述IL-2終濃度為50-500U/ml，IL-15的終濃度為10_500ng/ml ； (d)收集(c)步驟中得到的淋巴細胞用于回輸或凍存。2.如權利要求I所述的擴增方法，其特征是，所述步驟(a)抗CD3抗體的終濃度為l-75ng/ml，抗 CD28 抗體的終濃度為 2_30ng/ml ;IL_2 的濃度為 2000_4000U/ml。3.如權利要求I所述的培養方法，其特征是，步驟(c)中IL-2的終濃度為200-500U/ml，IL-15 的終濃度為 200-400ng/ml。4.如權利要求I所述的擴增方法，其特征是，所述步驟(a)中使用的淋巴細胞激活劑還含有激活劑PHA和/或IFN-r ;所述PHA的終濃度為l-100ng/ml，而IFN_r的終濃度為100-2000U/ml。5.如權利要求I所述的擴增方法，其特征是，所述步驟(c)還含有細胞因子IL-7、IL-12、IL-21中的ー種或幾種；所述IL-7的終濃度為10_200ng/ml，IL-12的終濃度為5-100ng/ml, IL-21 的終濃度為 l_200ng/ml。6.如權利要求I所述的擴增方法，其特征是，所述培養基為RPMI-1640培養基、DMEM培養基或者AIM-V培養基。7.權利要求1-6中任意一項所擴增的以CD3+CD8+為主的活化淋巴細胞的凍存方法，其特征是， Ce)取權利要求1-6的生長在對數期的以⑶3+⑶8+為主的活化淋巴細胞進行收集，收集方法為以300-2000r/min的速度離心，得到沉淀細胞； (g)將在(e)步驟中得到的細胞加入凍存液使細胞濃度為O.lX 107-5X 107/ml ;將制備的細胞懸液轉入凍存管中； (h)將(g)步驟中得到的凍存管放于程序降溫盒中在零下20°C放置1-5小時，再...

【專利技術屬性】
技術研發人員：高恒亮，郭棟，
申請(專利權)人：濟南泰生生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：