利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法技術

本發(fā)明專利技術公開了一種利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法，可供處理100份1μgDNA的水解混合液配制方法為：將250U?Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL?pH為7.9的Tris-HCl水解緩沖液內；流動相的pH：對于線粒體DNA，用磷酸調節(jié)pH至3.42；對于細胞核DNA，用磷酸調節(jié)pH至3.0；色譜條件為：色譜柱：C18填料色譜柱；流速：0.8mL/min，檢測器波長：287nm；柱溫：35℃；進樣量：20μL；流動相：甲醇：5mM戊烷磺酸鈉：三乙胺（10：90：0.2，V/V），并用磷酸調節(jié)pH分別至3.42和3.0。方法簡單易行，20min內可將各組分完全分離。?

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及，尤其涉及的是一種利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法。
技術介紹
隨著DNA甲基化研究的逐步深入，DNA甲基化水平的檢測已發(fā)展成為一門內容豐富的方法學。DNA甲基化常用的分析方法為MSAP法，該法被廣泛應用于水稻、棉花和擬南芥等基因組的胞嘧啶甲基化評定。但是，MSAP法所使用的同裂酶(如HpaII和MspI)不能切割所有的甲基化位點，識別范圍有限。相比較而言，HPLC法能方便、快速、準確地測定整個基因組的甲基化水平，它能在宏觀上對整個基因組的DNA甲基化水平進行大規(guī)模的分析測 定，這恰恰是具有識別位點特異性的MSAP法所不具備的。HPLC法是生物化學、分子生物學、醫(yī)藥學等學科領域與專業(yè)最為重要的分離分析技術，也可以應用于測定全基因組DNA甲基化水平。繼Wagner等首次用HPLC法測定植物5mC的含量以來，該法被廣泛應用于植物DNA甲基化水平的檢測。Johnston等用該方法對茶薦子基因組中5mC含量進行了分析，丁明麗用該法測定了小麥成熟胚脫分化過程中的DNA甲基化水平，表明HPLC方法可達到對植物DNA甲基化水平精確分析的目的。因此，運用高效液相色譜法能夠更加準確、全面地測定DNA甲基化水平。核酸的酶水解通常采用核酸酶P1、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶將DNA水解為脫氧核苷后進行測定。核酸酶Pl只能對DNA的單鏈產(chǎn)生作用；核酸酶Pl的最適反應溫度高于另外兩種酶，而最適pH值卻低于另外兩種酶，這就意味著三種酶不能同時作用，而且需人為地調節(jié)pH值，使實驗顯得格外繁瑣。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足提供一種利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法。本專利技術的技術方案如下利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法，可供處理100份I μ g DNA的水解混合液配制方法為將250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL pH為7. 9的Tris-HCl水解緩沖液內；流動相的pH :對于線粒體DNA，用磷酸調節(jié)pH至3. 42 ;對于細胞核DNA，用磷酸調節(jié)pH至3. O ;色譜條件為色譜柱C18填料色譜柱；流速0. 8 mL/min，檢測器波長287nm ;柱溫35°C ;進樣量20uL ;流動相甲醇5mM戊烷磺酸鈉三乙胺(10 90 :0. 2，V/V)，并用磷酸調節(jié)pH分別至3. 42和3.0。方法簡單易行，20min內可將各組分完全分離。(I)利用Benzonase、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶配置成水解體系,根據(jù)每ug DNA加上一定量的水解液，37°C水解6個小時即能獲得脫氧核苷。此法簡單、經(jīng)濟、有效。(2)對線粒體DNA和細胞核DNA甲基化水平的檢測條件有所不同流速、進樣體積、柱溫箱溫度均一致，但是流動相的PH不一樣。線粒體DNA分析時需要的pH略高于細胞核DNA，這樣才能使各時各組分得到較好的分離。(3)經(jīng)過優(yōu)化的色譜條件為，色譜柱C18填料色譜柱(4. 6X250mm,5um);流速O. 8 mL/min，檢測器波長287nm ;柱溫35°C ;進樣量20uL ;流動相甲醇5mM戊烷磺酸鈉:三乙胺(10 90 :0. 2，V/V)，并用磷酸調節(jié)pH分別至3. 42和3. O。方法簡單易行，20min內可將各組分完全分離。附圖說明圖I為標準品及樣品經(jīng)水解后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜；圖2為DNA標準品水解后HPLC色譜圖； 具體實施例方式以下結合具體實施例，對本專利技術進行詳細說明。DNA樣品經(jīng)酸或酶水解成堿基/核苷/核苷酸,本實驗利用Benzonase、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶配置成水解混合液，可供處理100份I μ g DNA的水解混合液配制方法為將250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL pH為7. 9的Tris-HCl水解緩沖液內。在I μ g 20 ng/ μ L的DNA中加入50 μ L水解混合液，37°C溫浴6小時后，_20°C冷藏待上機測定。啟動電腦、高效液相色譜儀的A泵、B泵、SPD檢測器、柱溫箱等，先用100%甲醇沖洗柱子lh，再用水甲醇(95 :5，v/v)過渡30min，最后用含緩沖鹽的流動相沖洗lh，平衡色譜柱至基線平穩(wěn)。將標準品溶液dC、5mC分別進樣，經(jīng)工作站軟件處理后得出洗脫峰、各自的保留時間和峰面積，接著將待測DNA樣品逐個上樣，根據(jù)標樣dC和5mC洗脫峰的保留時間自動檢測樣品DNA水解產(chǎn)物中dC和5mC的洗脫峰，通過公式(5mC/(511￡+(10\100%)，計算0嫩甲基化水平。樣品檢測完畢，先用流動相沖洗lh，然后用水甲醇(95 :5，v/v)過渡30min，再用甲醇沖洗Ih以上，待基線平穩(wěn)后關機。測定波長的優(yōu)化本實驗通過高效液相色譜儀二極管陣列檢測器多通道(波長)掃描，找出dC和5mC最大吸收峰，對應波長分別是278nm和287nm，本實驗在最大吸收峰波長周圍設計梯度實驗，對各供試波長所對應的峰面積進行測定，結果如表1，由表I可以看出，dC在這供試波長范圍內的峰面積相差不大，但是5mC的波動比較大，其中，在287nm處，5mC得到最大吸收，所以選擇287nm作為固定檢測波長。表I不同檢測波長下dC和5mC的峰面積 波長(nm)dC峰面積5mC峰面積r π273112068.7137436.6 275丨丨 6836.1149150.1 276118929.9丨 56430.3 277119339.615975(1.權利要求1.利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法，其特征在于，可供處理100份I μ g DNA的水解混合液配制方法為將250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL pH為7. 9的Tris-HCl水解緩沖液內；流動相的pH 對于線粒體DNA,用磷酸調節(jié)pH至3. 42 ;對于細胞核DNA,用磷酸調節(jié)pH至3. O ;色譜條件為色譜柱C18填料色譜柱；流速0. 8 mL/min，檢測器波長287nm ;柱溫35°C ;進樣量.20uL ;流動相甲醇5mM戊烷磺酸鈉三乙胺(10 90 :0. 2，V/V),并用磷酸調節(jié)pH分別至.3. 42 和 3. O。全文摘要本專利技術公開了一種利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法，可供處理100份1μgDNA的水解混合液配制方法為將250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL pH為7.9的Tris-HCl水解緩沖液內；流動相的pH對于線粒體DNA，用磷酸調節(jié)pH至3.42；對于細胞核DNA，用磷酸調節(jié)pH至3.0；色譜條件為色譜柱C18填料色譜柱；流速0.8mL/min，檢測器波長287nm；柱溫35℃；進樣量20μL；流動相甲醇5mM戊烷磺酸鈉三乙胺(10900.2，V/V)，并用磷酸調節(jié)pH分別至3.42和3.0。方法簡單易行，20min內可將各組分完全分離。文檔編號G01N30/88GK102944638SQ20121051956公開日2013年2月27日 本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
利用高效液相色譜法檢測玉米細胞核DNA和線粒體DNA甲基化水平的方法，其特征在于，可供處理100份1μg?DNA的水解混合液配制方法為：將250U?Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL?pH為7.9的Tris?HCl水解緩沖液內；流動相的pH：對于線粒體DNA，用磷酸調節(jié)pH至3.42；對于細胞核DNA，用磷酸調節(jié)pH至3.0；色譜條件為：色譜柱：C18填料色譜柱；流速：0.8?mL/min，檢測器波長：287nm；柱溫：35℃；進樣量：20uL；流動相：甲醇：5mM戊烷磺酸鈉：三乙胺（10：90：0.2，V/V），并用磷酸調節(jié)pH分別至3.42和3.0。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：曹墨菊，榮廷昭，張晨，張艷花，汪靜，盧艷麗，劉和洋，汪瀚宇，王繼玥，曾文兵，汪生慶，劉堅，高世斌，周樹峰，胡爾良，
申請(專利權)人：四川農(nóng)業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：