一種地衣芽孢桿菌及多階段發酵的方法技術

本發明專利技術公開了一種地衣芽孢桿菌及多階段發酵的方法，屬于發酵工程技術領域；所述的地衣芽孢桿菌，其分類命名為地衣芽孢桿菌，菌種的拉丁學名是Bacillus?licheniformis，參據的微生物：NJWGYH?833051，保藏日期是2012年5月25日，保藏中心登記入冊編號是CGMCC?No.6155。該方法主要包括：種子的活化、接種前準備及接種、多階段溶氧控制過程、分批補料發酵階段，以多階段發酵生產地衣芽孢桿菌，使其菌體活力得到了大幅度提高。本發明專利技術操作簡單，成本低，地衣芽孢桿菌菌體活力較高，有利于實現工業化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于發酵工程
，具體涉及一種高活力地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis CGMCC No. 6155。
技術介紹
地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是芽孢桿菌屬的一種,屬于革蘭氏陽性細菌，廣泛分布于土壤、空氣和其它自然環境中，具有豐富多樣的生理生化特性，作為土壤和植物微生態優勢種群，地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中極具應用潛力的菌種之一。目前，地衣芽孢桿菌在農作物病害防治方面的研究，在我國處于起步階段，發展空間相當廣闊。地衣芽孢桿菌可產生小分子細菌素、溶菌酶、抗菌蛋白以及多種抗生素(包括氨基酸類、磷脂類、脂肽類、多烯類、肽類、核酸類物質)等，可以抑制多種動、植物及人類病原菌。地衣芽孢桿菌為“公認安全(GRAS) ”的細菌，因此可以被廣泛應用于農藥、醫藥、食品、飼料加工、環境污染治理等各領域·地衣芽孢桿菌作為微生態制劑，主要是通過其所含活菌的積極生命活動而達到調節宿主微生態平衡的，因此，其制劑中活菌含量的高低是評定產品質量的一項關鍵指標。地衣芽孢桿菌制劑的抑菌機理，主要是通過所含活菌的生理與代謝活動而產生多種抗菌物質實現對有害菌的有效抑制，因此評定生物制劑產品質量的一項關鍵指標就是活菌含量的高低。地衣桿菌微生態制劑作為生物農藥發揮主要作用的是其芽孢，盡管芽孢桿菌以內生孢子的形式存在，且對加工、運輸過程中的干燥、高溫、高壓、氧化等不良環境因素的抵抗能力強、穩定性高，但目前地衣桿菌制劑仍普遍存在加工和運輸過程中以及有效期內活菌含量降低、貨架期短等問題。如能建立起一套系統的多階段發酵生產地衣芽孢桿菌的方法，特別對加工及貯存過程中地衣芽孢桿菌活力的保持進行深入研究，將可以為其它微生態制劑的發酵生產提供模板。
技術實現思路
本專利技術目的在于提供一種地衣芽孢桿菌；同時提供了利用上述地衣芽孢桿菌多階段發酵的方法。本專利技術的技術方案為一種地衣芽孢桿菌，其分類命名為地衣芽孢桿菌，菌種的拉丁學名是Bacillus licheniformis，參據的微生物NJWGYH 833051，保藏日期是2012年5月25日，保藏中心登記入冊編號是CGMCC No. 6155。本專利技術還提供了利用上述的地衣芽孢桿菌進行多階段發酵的方法；其具體步驟如下利用地衣芽孢桿菌來培養發酵種子液；將發酵培養基進行接種前準備、滅菌；然后將發酵種子液按發酵培養基體積的3-9%的比例接種到滅菌的發酵培養基中，通過控制葡萄糖的濃度進行有氧多階段發酵，得到地衣芽孢桿菌的菌體。優選所述的培養發酵種子液為從營養瓊脂培養基上挑取I個地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis單菌落接到含有種子培養基的錐形瓶中,種子培養基的體積為錐形瓶體積的10-20%，在溫度維持在30-40°C，pH為6. 0-8. 0，轉速為150_220rpm的搖床中培養10-20h，即為發酵種子培養液。優選所述的種子培養基成分為葡萄糖5. 0-20. Og/L，蛋白胨5. 0-15. Og/L，牛肉膏 3. 0-8. Og/L, NaCl 3. 0-8 . Og/L。上述的發酵培養基接種前準備為將發酵培養基溶于水中，攪拌均勻后，倒入發酵罐中，發酵培養基的裝液量為發酵罐體積的30%-60%，通入冷卻水，滅菌，滅菌前校正溶解氧DO為0% ;其中所述的發酵培養基的組分葡萄糖5. 0-20. Og/L，蛋白胨5. 0-15. 0g/L,酵母膏 3. 0-8. 0g/L,牛肉膏 3. 0-8. 0g/L, KH2PO4 l_5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5-2. 5g/L, NaCl3.0-8. Og/L, CaCO3 I. 0-5. Og/L, K2HP04 0. 5-2. 5g/L。優選上述的接種過程中發酵培養基的培養溫度30_40°C，控制pH6. 0-8. O ;調節好轉速、空氣流量及罐壓以校正溶氧DO 100%;所述的有氧多階段發酵為發酵過程的前3 20h為菌體生長階段，通氣量為10-15L/min，攪拌速度為300-400rpm，溶氧水平DO控制在50-100% ;發酵過程的20-35h是芽孢形成階段，當細胞光密度達到25-30時，調節空氣流量為16. 0-20. 0L/min，攪拌速度為200_300rpm，溶解氧水平控制在10-30%。優選在有氧多階段發酵過程中，當葡萄糖濃度低于2. 5g/L時，開始流加底物，并以發酵液中葡萄糖的濃度來指導底物流加速度，使發酵罐內葡萄糖濃度控制在2. 5-3. 5g/L范圍內發酵8-16h ;其中流加底物組成為葡萄糖250-350g/L，牛肉膏100_200g/L，KH2PO45-10g/L。上述地衣芽抱桿菌Bacillus licheniformis參據的微生物NJWGYH 833051是由本實驗室自己分離得到。初篩得到23株菌；經搖瓶復篩，進行產酶試驗、生物好氧實驗、抑菌試驗，獲得一株菌，通過生理生化特性實驗和16S rDNA序列相似性分析，獲得一株分類鑒定命名為地衣芽孢桿菌，并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，登記入冊的編號是CGMCC No. 6155。以此菌種作為生產菌株。CGMCC No. 6155菌株具有下述性質I、培養特征該菌落在營養瓊脂上37°C培養24h，形成圓形凸起菌落，菌落邊緣整齊，有光澤，呈乳白色、微透明，菌落表面偏光滑。2、菌體及芽孢的形態特征在營養瓊脂培養基平板上37°C培養，16-25h形成脫落的芽孢，到25_35h芽孢大部分脫落。菌體呈鏈狀桿菌，菌體大小約為0. SumX 2. Oum，橢圓形或柱狀芽孢，芽孢位于桿菌中心或偏中生。3、生理生化性質表I CGMCC No. 6155菌株的生理生化性質權利要求1.一種地衣芽孢桿菌，其分類命名為地衣芽孢桿菌，菌種的拉丁學名是Bacilluslicheniformis，參據的微生物=NJffGYH 833051，保藏日期是2012年5月25日，保藏中心登記入冊編號是CGMCCNo. 6155。2.一種利用如權利要求I所述的地衣芽孢桿菌進行多階段發酵的方法；其具體步驟如下利用地衣芽孢桿菌來培養發酵種子液；將發酵培養基進行接種前準備、滅菌；然后將發酵種子液按發酵培養基體積的3-9%的比例接種到滅菌的發酵培養基中，通過控制葡萄糖的濃度進行有氧多階段發酵，得到地衣芽孢桿菌的菌體。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的培養發酵種子液為從營養瓊脂培養基上挑取I個地衣芽孢桿菌Bacillus Iicheniformis單菌落接到含有種子培養基的錐形瓶中，種子培養基的體積為錐形瓶體積的10-20%，在溫度維持在30-40°C，pH為6. 0-8. 0，轉速為150-220rpm的搖床中培養10_20h，即為發酵種子培養液。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述的種子培養基成分為葡萄糖5. 0-20. Og/L，蛋白胨 5. 0-15. Og/L，牛肉膏 3. 0-8. Og/L, NaCl 3. 0-8. Og/L。5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的發酵培養基接種前準備為將發酵培養基溶于水中，攪拌均勻后，倒入發酵罐中，發酵培養基的裝液量為發酵罐體積的3本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種地衣芽孢桿菌，其分類命名為地衣芽孢桿菌，菌種的拉丁學名是Bacilluslicheniformis，參據的微生物：NJWGYH?833051，保藏日期是2012年5月25日，保藏中心登記入冊編號是CGMCCNo.6155。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：胡永紅，楊文革，江心敏，唐容容，沈飛，馮旌，
申請(專利權)人：南京工業大學，
類型：發明
國別省市：