本發明專利技術公開了一種農藥烯啶蟲胺半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法與應用，涉及具有6－羧乙巰基分子結構的煙堿類農藥烯啶蟲胺小分子化合物人工半抗原、免疫原，包被原和抗體的制備及其免疫分析方法的建立方面。本發明專利技術克服了傳統的理化分析方法繁瑣復雜、成本較高、分析速度慢的問題，提供了簡便、快速、靈敏、準確的免疫分析技術。它以(E)-N-(6-羧乙巰基-3-吡啶甲基)-N-乙基-N＇-甲基-2-硝基亞乙基二胺為半抗原，分別與牛血清蛋白和卵清蛋白連接合成免疫原和包被原。人工抗原再經動物免疫、取血、分出抗血清、純化制得抗體。使用該抗體建立的烯定蟲胺免疫檢測方法具有良好的特異性和靈敏度，檢測限可以穩定達到0.20±0.02ng?L-1，且半抗原合成方法簡便，具有良好的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于農藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)免疫化學和殘留分析
；涉及有機合成，免疫化學，生物化學及物化測試試技術等；特別涉及具有6 —羧乙巰基分子結構的煙堿類農藥烯啶蟲胺小分子化合物半抗原、人工抗原的設計合成，和免疫動物特異性抗體的制備及其免疫分析方法的建立。
技術介紹
烯啶蟲胺又名吡蟲胺，是繼吡蟲啉之后的第二代新煙堿類殺蟲劑，是目前最新的煙堿類殺蟲劑之一，其殺蟲機理與傳統的殺蟲劑有所不同。烯啶蟲胺作用于昆蟲神經接合部后膜，通過與乙酰膽堿受體結合使昆蟲異常興奮，全身痙攣，麻痹而死。烯啶蟲胺具有高效、低毒、內吸和無交互抗性四大優點，是防治同翅目及半翅目害蟲的優良藥劑，可廣泛應用于糧谷、蔬菜、水果和茶樹上防治各種稻飛虱、蚜蟲、薊馬、白粉虱、煙粉虱、葉蟬、薊馬等刺吸式口器害蟲，對傳統殺蟲劑已產生抗性的害蟲有較好的防治效果，是至今煙堿類農藥發展最新產品之一。由于烯啶蟲胺在我國使用日益廣泛，我國許多農產品中存在烯啶蟲胺殘留。隨著農藥使用規模不斷擴大，農藥殘留造成環境影響和對人類健康的慢性和長期效應，日益受到人們關注和擔憂。為此，對農藥殘留的限制也因此越來越嚴格，并且對分析測定對象、種類、數量、范圍、指標等諸方面，都提出新的要求和更高的標準。日本肯定列表對于烯啶蟲胺在農產品中的殘留量，有較嚴格的檢測標準，最高允許殘留量(MRL)為O. 03至O. 5mg kg_l。然而，由于分子量小于lOOOdolton (道爾頓)的小分子有毒化學品，如農藥及其代謝產物，其傳統的殘留分析方法，主要是依靠氣相色譜(GC)、液相色譜(HPLC)或質譜等物化分析手段。該傳統的理化分析方法，繁瑣復雜、成本較高、分析速度慢，難以滿足實際分析的需要，因此迫切要求發展簡便、快速、靈敏的分析技術。與大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特點(I)小分子化合物〔MW ( lOOOdolton〕一般不具有免疫原性，不能直接免疫動物產生特異性抗體、必須合成突出分子立體結構特異性部位的半抗原，并與大分子載體連接構成接合物，才能免疫動物產生針對這一目標小分子化合物的特異性抗體。這種半抗原與大分子載體的結合物稱為人工抗原。人工抗原的制備不是任意的，包括結合位點、結合方式、載體種類、以及半抗原與目標分析物任何結構上的差異如大小、形狀、成份、構型、構象、極性、電子云密度等等在內的諸因素，都可能極大地影響著相應抗體的性質，因此它們是決定產生其特異性抗體和建立免疫分析方法的關鍵。(2)雖然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反應原性，即具有與相應抗體發生免疫學反應的能力，并可體外定量進行，遵循質量作用定律。(3)基于抗原抗體免疫反應檢測小分子化臺物的分析技術，目前多采用酶聯免疫分析(ELISA)。利用酶促反應顯示抗原抗體的定量結合，操作簡單，又具有相當的靈敏度，近年來發展很快。80年代以來發展起來的農藥ELISA和簡易酶免疫EIA技術，使農藥殘留分析在方法上獲得更大的生命力；對使用快速分析樣本基質過于復雜，用普通理化方法難以分析的農藥殘留，具有相當的應用價值。免疫分析技術被引入農藥殘留分折領域，成為一種最有發展和應用潛力的報量分析技術之一，受到廣泛的重視。第一個農藥免疫分析的報道是1967年Centen等人制備的農藥馬拉硫磷的抗血清。1980年Hammock和Mumma,進一步探討了農藥免疫分析方法的理論和技術之后，使ELISA農藥分折技術，進入了一個嶄新的階段。農藥小分子化合物(分子量小于1000道爾頓)，依靠免疫學、免疫化學基本原理和生物技術手段。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和人工全抗原及抗體的制備。因此，目標分析物分子免疫學特性，以及如何通過化學或生化技術突出和利用這些特性，是該領域重要的研究內容。這一技術目前已成為微量分析研究的一個嶄新領域，可與傳統分析方法并列作為一項新的分析途徑。烯啶蟲胺人工抗原和特異性抗體以及以此為基礎建立免疫分析方法尚未見報道
技術實現思路
本專利技術的目的是通過設計合成具有6 —羧乙巰基分子結構的煙堿類農藥烯啶蟲胺的半抗原及相應的人工抗原和抗體。本專利技術的另一個目的是提供烯啶蟲胺的半抗原及相應的人工抗原和抗體的制備方法。本專利技術再一個目的是提供烯啶蟲胺的半抗原及相應的人工抗原和抗體的應用。其中纟布Ffe蟲胺的人工抗原包括免疫原和包被原。本專利技術的獨特之處在于突出了這類農藥分子特異性抗原決定簇，又克服了化學合成的困難，免疫動物誘導產生親合性很高的特異性抗體；并以此為基礎建立了 ELISA方法即快速免疫分析方法，準確檢測煙堿類農藥烯啶蟲胺。本專利技術設計、合成了小分子目標分析物半抗原，并與載體蛋白質偶聯，制備有效人工抗原，免疫動物制備對小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學反應，從而定性定量地檢測樣本中超微量小分子目標分析物，即可用于樣本測定。其選擇性決定于免疫學反應的特異性，其靈敏度取決于抗體的親合性和標記物的可檢性。因此可以快速準確地分析檢測烯啶蟲胺在樣本中的殘用量。該技術研究的關鍵是半抗原的分子設計、合成和人工全抗原及抗體的制備。人工抗原是合成半抗原與載體蛋白的偶聯物，若用于免疫動物，即為免疫原，若用于免疫分析中包被反應板，即為包被原。對于同一種目標分子，免疫原和包被原通常不用同一種偶聯物，目的是減少抗體對包被原的非特異性結合，提高分析的特異性和靈敏度。因為人工抗原免疫動物所產生的抗體，不僅能識別半抗原，也能識別載體蛋白。因此，免疫原和包被原所用的載體蛋白一般是不相同的，載體蛋白的結構和分子質量差異越大，非特異性結合反應越弱，分析靈敏度越高。烯啶蟲胺的結構如下所示權利要求1.一種烯啶蟲胺半抗原，其特征在于分子結構式為2.一種烯啶蟲胺免疫原，是由權利要求I所述的烯啶蟲胺半抗原與牛血清蛋白相連接合成，其特征在于，所述烯啶蟲胺人工抗原分子結構式為3.一種烯啶蟲胺包被原，是由權利要求I所述的烯啶蟲胺半抗原與卵清蛋白相連接合成，其特征在于，所述烯啶蟲胺包被原分子結構式為4.一種烯啶蟲胺抗體，是能與權利要求2免疫原或權利要求3包被原發生特異性免疫反應的IgG抗體。5.權利要求I所述的烯啶蟲胺半抗原的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將烯啶蟲胺5.400-5. 500g溶于40ml甲醇，投入三口燒瓶中； (2)加入KOH2. 200-2. 300g，磁力攪拌使其溶解； (3)稱取3-巰基丙酸2.100-2. 200g溶于IOml甲醇并轉移至50ml恒壓滴液漏斗中緩慢滴加到三口燒瓶中，并使油浴緩慢升溫至100-105°C，反應完全后撤去油浴，反應液自然冷卻至室溫后，用旋轉蒸發儀蒸干溶劑即得到目標產物。6.權利要求2所述的烯啶蟲胺免疫原的制備方法為活性酯法，其特征在于，所述活性酯法包括以下步驟 (O首先移取ImL的無水二甲基甲酰胺于4mL的小棕瓶中； (2)稱取5.100-5. 200mg烯啶蟲胺半抗原溶于上述二甲基甲酰胺溶液中并超聲5min使其溶解充分，在攪拌的狀態下，依次向其中加入15. 600-15. 700mgN, N ; 二環己基碳二亞胺和8. 700-8. 800mgN-N-羥基琥珀酰亞胺，溶解充分以后，室溫避光攪拌反應22-24小時； (3)反應后溶液中有沉淀產生，4°C，本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種烯啶蟲胺半抗原，其特征在于分子結構式為：FDA00002338762400011.jpg
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王俊平，生威，張昕哲，王碩，張燕，
申請(專利權)人：天津科技大學，
類型：發明
國別省市：
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