本發(fā)明專利技術(shù)涉及甲基阿魏酸在制備預(yù)防和治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，根據(jù)體外細(xì)胞模型證實(shí)甲基阿魏酸對大鼠原代肝星狀細(xì)胞（hepaticstellatecell,HSC）增殖及膠原合成具有明顯抑制作用；動(dòng)物試驗(yàn)表明甲基阿魏酸對小鼠四氯化碳(CCl4)和D-氨基半乳糖(D-Gal)造成的急牲肝損傷具有保護(hù)作用，可以預(yù)防肝纖維化的發(fā)生；以CCL4所致的化學(xué)性肝纖維化大鼠模型和牛血清白蛋白所致的免疫性肝纖維化大鼠模型證實(shí)甲基阿魏酸對慢性肝纖維化具有較好的治療作用，可單方或復(fù)方用于制備預(yù)防和治療肝纖維化的藥物。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及醫(yī)藥
，具體地說是甲基阿魏酸在制備預(yù)防和治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度增生與異常沉積所致肝臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變的一種病理變化。幾乎所有的慢性肝病，包括慢性乙型(丙型)病毒性肝炎、慢性酒精性與自身免疫性肝病等均經(jīng)歷這一病理過程，并隨著肝纖維化的進(jìn)一步發(fā)展，形成肝硬化，嚴(yán)重危害人類健康，尋找有效的預(yù)防與治療肝纖維化的藥物意義重大。 蝶翼藤(Securidaca inappendiculata Hassk)為遠(yuǎn)志科遠(yuǎn)志族蝶翼藤屬攀援灌木，是廣西民族特色中草藥，廣西民間稱五味藤、丟了棒、一摩消等。其根莖味辛、甘、苦，性微寒，有祛風(fēng)濕、清熱利尿、活血化瘀、消腫止痛的功效。現(xiàn)有報(bào)道表明，蟬翼藤具有較強(qiáng)的抗菌消炎、抗癌、抗病毒、抗HIV、免疫增強(qiáng)等多種活性，但至今未見到用從蟬翼藤中提取得到的甲基阿魏酸治療肝纖維化疾病的相關(guān)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供甲基阿魏酸的新用途，即在制藥中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是一種甲基阿魏酸的新用途，它是用于治療肝纖維化，即是將從蟬翼藤中提取出的甲基阿魏酸制成片劑、膠囊、顆粒或注射劑等劑型以治療肝纖維化，其劑量為50-200mg/kg甲基阿魏酸/日，可分成2-3次服用。本專利技術(shù)所述甲基阿魏酸是從蟬翼藤莖皮提取得到的有機(jī)酸類化合物，其提取工藝為將蟬翼藤莖皮粉碎，95%乙醇回流提取3次一浸膏用100 200目硅膠拌樣一以氯仿回流洗脫一洗脫液減壓濃縮一中壓硅膠色譜三氯甲烷乙醚(I 5)梯度洗脫一收集洗脫液，揮去溶劑得白色粉末結(jié)晶一再經(jīng)重結(jié)晶和Si^phadex LH220凝膠柱色譜純化(甲醇洗脫)—得到白色針狀結(jié)晶。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為甲基阿魏酸，化學(xué)名為3，4- 二甲氧基-苯丙烯酸，分子結(jié)構(gòu)式如下 H3CO %TD八 H3CO^ W'ODOH 經(jīng)體外細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)和在體的急、慢性動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明甲基阿魏酸具有預(yù)防與治療肝纖維化作用，體外細(xì)胞模型證實(shí)甲基阿魏酸對大鼠貯脂細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞增殖及膠原合成具有明顯抑制作用；動(dòng)物試驗(yàn)表明甲基阿魏酸對小鼠四氯化碳(CCL4)和D-氨基半乳糖(D-Gal)造成的急牲肝損傷具有保護(hù)作用，可以預(yù)防肝纖維化的發(fā)生；以CCL4K致的化學(xué)性肝纖維化大鼠模型和牛血清白蛋白所致的免疫性肝纖維化大鼠模型證實(shí)甲基阿魏酸對慢性肝纖維化具有較好的治療作用。以上細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲基阿魏酸具有確切的抗肝纖維化作用，可單方或復(fù)方用于制備預(yù)防和治療肝纖維化的藥物。具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本專利技術(shù)作進(jìn)一步的闡述 實(shí)施例I甲基阿魏酸對大鼠貯脂細(xì)胞株HSC-T6細(xì)胞的增殖和膠原合成的抑制作用的試驗(yàn) 將HSC-T6細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 105/ml，每孔ΙΟΟμΙ，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。37°C下置5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，去培養(yǎng)基，以含不同濃度藥物(甲基阿魏酸終濃度為2. 5μ g/ml、5l·! g/ml、10l·! g/ml、20l·! g/ml,40yg/ml)的培養(yǎng)基孵育24小時(shí)，同時(shí)設(shè)立空白對照組，每一樣品設(shè)5個(gè)復(fù)孔，然后每孔 加入MTT (5mg/ml) 20ul繼續(xù)孵育4h，將培養(yǎng)基倒盡，吸干，每孔加入二甲亞砜200ul，混勻后置自動(dòng)酶標(biāo)儀(檢測波長490nm)讀取各孔光密度值，記錄結(jié)果，并計(jì)算抑制率，結(jié)果見表I。按同樣方法將生長良好的HSC細(xì)胞株接種于96孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至細(xì)胞生長融合以消除細(xì)胞生長對膠原合成的影響后，通過3H-脯氨酸摻入法用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測定樣品放射性強(qiáng)度，計(jì)算甲基阿魏酸對HSC-T6細(xì)胞膠原合成的抑制率，結(jié)果見表I。表I.甲基阿魏酸對HSC-T6細(xì)胞增殖和膠原合成抑制率 甲基阿魏酸濃度|HSC-T6細(xì)胞增殖抑制率(％)|HSC-T6細(xì)胞膠原合成抑制率(％)0~—O~0 Yl μ g/ml —41.11~22. 21 StTg/ml—49.06~ 30. 13 Τθ~μ g/ml— 56.92— 40.05 20~μ g/ml— 64. 70~61. 52 ￥~μ g/ml 丨75· 67丨82· 87 由表I可看出，與空白對照組比較，甲基阿魏酸對HSC-T6細(xì)胞增殖和膠原合成均有明顯抑制作用，且隨著甲基阿魏酸的濃度增高，對HSC-T6細(xì)胞增殖和膠原合成的抑制作用也隨之增強(qiáng)。對HSC-T6細(xì)胞增殖抑制率高，表明HSC-T6細(xì)胞的活力低；對HSC-T6細(xì)胞膠原合成抑制率高，則表明HSC-T6細(xì)胞的膠原合成作用弱，而HSC-T6細(xì)胞與肝纖維化密切相關(guān)，由此可見，甲基阿魏酸對肝纖維化的進(jìn)程具有抑制作用。實(shí)施例2甲基阿魏酸對CCl4及D-Gal造成的急性肝損傷動(dòng)物模型的影響的試驗(yàn) I.藥物和動(dòng)物 I.I動(dòng)物昆明種小鼠110只，雌雄各半，體重22±2g。1.2動(dòng)物分組隨機(jī)將動(dòng)物分成11組，每組10只。第I組為正常動(dòng)物對照組，其余各組為模型組。其中，第2、3、4、5、6組用CCL4造模，即使用CCl4致小鼠急性肝損傷；而第7、8、9、10、11用D-Gal造模，即用D-Gal致小鼠急性肝損傷。1.3治療藥物 (I)聯(lián)苯雙酯，此為傳統(tǒng)保肝藥，是經(jīng)SFDA批準(zhǔn)上市的藥品，為用作陽性對照藥。(2)甲基阿魏酸，為試驗(yàn)藥物，觀察其對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。2.實(shí)施方案2.I劑量設(shè)置 第I組為正常對照組，第2組為CCL4模型對照組，第7組為D-Gal模型對照組。第I、2、7組以溶媒灌胃，劑量為10ml/kg ； 第3、8組為聯(lián)苯雙酯治療組，劑量為200mg/kg，作為甲基阿魏酸治療組的陽性對照組；第4、5、6組和第9、10、11組依次分別為甲基阿魏酸低、中、高劑量治療組，劑量依次分別為 50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg。2.2給藥方法 上述各組先按給藥劑量灌胃2天，每天I次。第3天時(shí)，將第2、3、4、5、6組用O. 5%的CCL4-花生油以10ml/kg劑量腹腔注射I次，造急性CCL4肝損傷模型；第7、8、9、10、11組用D-Gal以800mg/kg劑量腹腔注射I次，建立急性D-Gal肝損傷模型。造模型后當(dāng)天開始，各組改為每天灌胃2次，連續(xù)2天，劑量同上。2. 3觀測指標(biāo) 在造肝損傷模型48小時(shí)后，對試驗(yàn)小鼠取血和肝臟，按常規(guī)試劑盒方法測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性及肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Ρχ)等指標(biāo)，這些指標(biāo)均能反映肝損傷的情況，測定結(jié)果見表2。3.結(jié)果 表2甲基阿魏酸對急性肝損傷小鼠的血清學(xué)及肝功能指標(biāo)的影響權(quán)利要求1.甲基阿魏酸在制備預(yù)防和治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征是所述甲基阿魏酸是通過將蟬翼藤莖皮粉碎，95%乙醇回流提取3次一浸膏用100 200目硅膠拌樣一以氯仿回流洗脫一洗脫液減壓濃縮一中壓硅膠色譜三氯甲烷乙醚(I 5)梯度洗脫一收集洗脫液，揮去溶劑得白色粉末結(jié)晶一再經(jīng)重結(jié)晶和Sephadex LH220凝膠柱色譜純化得到的。全文摘要本專利技術(shù)涉及甲基阿魏酸在制備預(yù)防和治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，根據(jù)體外細(xì)胞模型證實(shí)甲基阿魏酸對大鼠原代肝星狀本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
甲基阿魏酸在制備預(yù)防和治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用，其特征是：所述甲基阿魏酸是通過將蟬翼藤莖皮粉碎,95%乙醇回流提取3次→浸膏用100～200目硅膠拌樣→以氯仿回流洗脫→洗脫液減壓濃縮→中壓硅膠色譜三氯甲烷:乙醚（1∶5）梯度洗脫→收集洗脫液，揮去溶劑得白色粉末結(jié)晶→再經(jīng)重結(jié)晶和Sephadex?LH220?凝膠柱色譜純化得到的。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李勇文，李麗，李勇軍，容明智，龐勇軍，黎榮，程鈺，龐文簫，
申請(專利權(quán))人：桂林醫(yī)學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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