蛋白質的選擇性修飾制造技術

本發明專利技術公開了一種在鄰近蛋白質上歸巢肽的結合位點處將取代基選擇性引入蛋白質的方法，所述方法包括：(a)使蛋白質與包含歸巢肽的化合物接觸，所述歸巢肽具有與蛋白質的結合位點結合的能力；和(b)允許蛋白質上鄰近該結合位點的部分與包含歸巢肽的化合物反應，從而將取代基G轉移到蛋白質上。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及將取代基選擇性引入蛋白質的方法、靶定試劑及其在所述方法中的用途、以及可由所述方法獲得的蛋白質。_2]
技術介紹
用于制藥目的的蛋白質的選擇性修飾為日益重要的領域。通過選擇性修飾蛋白質，例如通過加入聚乙二醇(PEG)，可改進蛋白質的藥理學特征和半壽期。具體而言，需要產生蛋白質的長效變體以用作藥物。已開發許多技術以選擇性修飾蛋白質的特定區。對于諸如因子VIII和Von Willebrand因子(vWF)等大型蛋白質而言，選擇性修飾尤其困難。可通過使其與非選擇性試劑反應來修飾蛋白質，所述非選擇性試劑能夠與蛋白質上的殘基形成鍵。通過這類方法將形成大范圍的不同產物，因為所述試劑可與蛋白質上任何合適的殘基反應。此技術的擴展包括使用配體封閉蛋白質上的特定位點，所述配體與這些位點結合。然后向非選擇性試劑中加入配體/蛋白質綴合物，所述非選擇性試劑與蛋白質上未封閉的位點反應，留下封閉的位點不被修飾。亦已研究蛋白質的選擇性修飾。用于選擇性修飾蛋白質的一項技術涉及在蛋白質中預先確定的位點上引入半胱氨酸殘基作為突變。然后可使突變的蛋白質與以下試劑反應，所述試劑選擇性地與半胱氨酸殘基反應以得到選擇性修飾的蛋白質。另一項技術涉及，通過使蛋白質與以下復合物反應來直接向蛋白質中加入大型取代基(通常為PEG)，所述復合物包含大型取代基和與蛋白質選擇性結合的配體。Dawson 等，Journal of Thrombosis and Haemostasis, 5，iY 似你闡述了利用靶向配體和光致交聯反應將標記引入凝血酶的技術。因此需要更有效且更具選擇性的技術用于修飾蛋白質、尤其是大型蛋白質。專利技術概沭本專利技術人設計了在鄰近因子VIII上歸巢肽(homing peptide)的結合位點處，將取代基選擇性引入因子VIII的新方法。此方法具有普遍適用性，并且可用于將取代基選擇性引入任何蛋白質，但是對于大型蛋白質而言尤其有用。本專利技術方法的一個應用為提供具有增加的血漿半壽期的修飾蛋白質。這類長效修飾的蛋白質有可能用作藥物，因為增加的血漿半壽期可允許減小的劑量和/或減少的給藥頻率。因此，本專利技術提供在鄰近蛋白質上歸巢肽⑵的結合位點處，將取代基(G)選擇性引入蛋白質的方法，所述方法包括(a)使蛋白質與式(I)化合物(“靶定試劑”)接觸以使靶定試劑與蛋白質結合權利要求1.一種在鄰近蛋白質上歸巢肽(P)的結合位點處將取代基(G)選擇性引入蛋白質的方法，所述方法包括(a)使蛋白質與式(I)化合物(“靶定試劑”)接觸以使靶定試劑與蛋白質結合2.根據權利要求I的方法，其中所述歸巢肽不含攜帶未取代ε-氨基的任何賴氨酸殘基，并且其中所述靶蛋白包含表面暴露的賴氨酸，以及其中所述靶定試劑的總質量不超過3000 Da03.根據權利要求I或權利要求2的方法，其中所述蛋白質為因子VII、因子Vila、因子VIIKVon Willebrand因子(vWF)、組織因子(TF)、細胞因子、生長激素、抗體或其抗原結合片段。4.根據權利要求3的方法，其中所述蛋白質為因子VIII。5.根據權利要求4的方法，其中所述歸巢肽(P)包含以下氨基酸序列(SEQID NO1-44)之一6.根據上述權利要求中任一項的方法，其中所述接頭L為式(II)基團7.根據上述權利要求中任一項的方法，其中至少一個所述取代基G為能夠后續修飾的取代基(G1)。8.根據權利要求7的方法，其中G1包含醛、酮、縮醛、半縮醛、疊氮化物、炔、吡啶基二硫化物、烷氧基胺或其任何衍生物。9.根據權利要求7或8中任一項的方法，所述方法還包括(c)使在鄰近所述結合位點處攜帶取代基G1的所得蛋白質與包含取代基R的修飾試劑反應，從而提供攜帶所述取代基R的蛋白質。10.根據權利要求9的方法，其中所述取代基R為能夠增加蛋白質的血漿半壽期的取代基。11.根據權利要求9或10的方法，其中R包含二膦酸鹽、與血小板或內皮細胞結合的取代基、抗體、親水聚合物、白蛋白或白蛋白結合劑。12.根據權利要求11的方法，其中所述親水聚合物為聚乙二醇(PEG)。13.一種蛋白質，所述蛋白質在鄰近蛋白質上歸巢肽的結合位點處被取代并且所述蛋白質可通過上述權利要求中任一項的方法獲得。14.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如在權利要求13中定義的蛋白質以及藥學上可接受的稀釋劑或載體。全文摘要本專利技術公開了一種在鄰近蛋白質上歸巢肽的結合位點處將取代基選擇性引入蛋白質的方法，所述方法包括(a)使蛋白質與包含歸巢肽的化合物接觸，所述歸巢肽具有與蛋白質的結合位點結合的能力；和(b)允許蛋白質上鄰近該結合位點的部分與包含歸巢肽的化合物反應，從而將取代基G轉移到蛋白質上。文檔編號A61K38/37GK102939110SQ201180030715 公開日2013年2月20日 申請日期2011年4月12日 優先權日2010年4月21日專利技術者M.科福德-漢森, H.R.施滕尼克, S.奧斯特加爾德, H.奧斯特加爾德 申請人:諾沃—諾迪斯克有限公司本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：M科福德漢森，HR施滕尼克，S奧斯特加爾德，H奧斯特加爾德，
申請(專利權)人：諾沃—諾迪斯克有限公司，
類型：
國別省市：