本發明專利技術提供了結合人組織因子途徑抑制劑(TFPI)的分離的單克隆抗體。還涵蓋編碼結合TFPI的單克隆抗體的分離的核酸分子。還提供了包含抗TFPI單克隆抗體的藥物組合物和通過施用該抗體治療凝固缺乏或缺陷的方法。還提供了生成所述抗體的方法。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】針對組織因子途徑抑制劑(TFPI)的優化的單克隆抗體Zhuozhi Wang, Junliang Pan，Joanna Grudzinskaj Christian Votsmeierj Jan Tebbej Joerg Birkenfeldj Nina Wobstj Simone Briicknerj Susanne Steinigj Peter Scholz序列表提交與本申請有關的序列表經由EFS網以電子形式提交，并且在此通過提及而將其完整收入說明書中。專利
提供了結合人組織因子途徑抑制劑(TFPI)的分離的單克隆抗體及其片段。專利技術背景血液凝固(blood coagulation)是血液形成穩定的凝塊以使流血停止的過程 (process) 0該過程牽涉血液中循環的許多酶原和輔因子原(或“凝固因子”)。那些酶原和輔因子原經由序貫或同時將它們轉化成活化形式的數種途徑而相互作用。最后，所述過程導致在存在因子Va、離子鈣、和血小板的情況中由激活的因子X(FXa)將凝血酶原激活為凝血酶。激活的凝血酶繼而誘導血小板聚集，而且將血纖蛋白原轉化成血纖蛋白，其然后被激活的因子XIII (FXIIIa)交聯以形成凝塊。可以通過兩種獨特的途徑來實施導致因子X激活的過程接觸激活途徑(以前稱為內源性途徑)和組織因子途徑(以前稱為外源性途徑)。先前認為，凝固級聯由連接至共同途徑的同等重要的兩種途徑組成。現在知道用于啟動血液凝固的主要途徑是組織因子途徑。因子X可以被與激活的因子VII (FVIIa)聯合的組織因子(TF)激活。因子VIIa和其必需的輔因子TF的復合物是凝固(clotting)級聯的一種有力的引發劑(initiator)。凝固的組織因子途徑受組織因子途徑抑制劑(“TFPI，，)負控制。TFPI是FVIIa/TF 復合物的一種天然的、FXa依賴性反饋抑制劑。它是多價Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑的成員。在生理學上，TFPI結合激活的因子X(FXa)以形成異二聚體復合物，其隨后與FVIIa/ TF復合物相互作用以抑制其活性，如此關閉凝固的組織因子途徑。原則上，阻斷TFPI活性可以恢復FXa和FVIIa/TF活性，如此延長組織因子途徑作用的持續時間，而且放大FXa的生成，所述FXa是血友病A和B的共同缺陷。實際上，一些初步實驗證據已經指明，通過針對TFPI的抗體來阻斷TFPI活性使延長的凝固時間正常化或者縮短流血時間。例如，Nordfang等顯示了血友病血漿的延長的稀釋凝血酶原時間(dilute prothrombin time)在用針對TFPI的抗體處理血楽■后正常化(Thromb. Haemost, 1991, 66 (4) : 464-467)。類似地，Erhardtsen 等顯不了通過抗TFPI抗體顯著縮短血友病A兔模型中的流血時間(Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1995，6:388-394)。這些研究提示了抗TFPI抗體對TFPI的抑制對于治療血友病A或B可以是有用的。在這些研究中僅使用多克隆抗TFPI抗體。使用雜交瘤技術，制備并鑒定針對重組人TFPI (rhTFPI)的單克隆抗體。參見 Yang等，Chin. Med. J.，1998，111(8) : 718-721。測試了單克隆抗體對稀釋凝血酶原時間(PT)和激活部分促凝血酶原激酶時間(APTT)的影響。實驗顯示了抗TFPI單克隆抗體縮短因子IX缺乏型血漿的稀釋促凝血酶原激酶凝固時間。提示了組織因子途徑不僅在生理學凝固而且在血友病出血中發揮重要作用(Yang等，Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 1997，22(4) : 297-300)。因而，需要對TFPI特異性的抗體來治療血液學疾病和癌癥。一般而言，已經使用遺傳工程來創建鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗體以生成用于人疾病的治療性抗體。顯示了鼠單克隆抗體作為治療劑具有有限的用途， 這是由于短的血清半衰期、不能觸發人效應器功能、和人抗小鼠抗體的生成(Brekke 和 Sandlie, “Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-first Century, ” Nature 2, 53, 52-62，(2003 年 I 月)。已經顯不了嵌合抗體引起人抗嵌合抗體應答。人源化抗體進一步使抗體的小鼠構件最小化。然而，完全人抗體完全避免與鼠元件有關的免疫原性。如此，需要開發完全人抗體以避免與其它形式的遺傳工程化單克隆抗體有關的免疫原性。特別地，若使用具有鼠構件或鼠起源的抗體，則諸如用抗 TFPI單克隆抗體的血友病治療會需要的長期(chronic)預防處理具有形成對該治療的免疫應答的高風險，這是由于需要的頻繁劑量給藥和長的療法持續時間。例如，血友病A的抗體療法可以每周需要劑量給藥，持續患者一生。這對免疫系統會是連續的考驗。如此，需要用于血友病和相關的遺傳性和獲得性凝固缺乏或缺陷的抗體療法的完全人抗體。已經經由由Koehler 和 Milstein 在“Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity, Mature 256, 495-497 (1975)中所描述的雜交瘤技術來生成治療性抗體。也可以在原核生物和真核生物中重組生成完全人抗體。 治療性抗體優選抗體在宿主細胞中的重組生成而不是雜交瘤生成。重組生成具有如下的優點，即較大的產物一致性、可能地較高的生產水平、和受控制的制備，其使動物衍生的蛋白質的存在最小化或消除動物衍生的蛋白質的存在。出于這些原因，想要具有重組生成的單克隆抗TFPI抗體。另外，因為TFPI以高親和力結合活化的因子X(FXa)，所以有效的抗TFPI抗體應當具有相當的親和力。如此，期望具有可以與TFPI/FXa結合競爭的結合親和力的抗TFPI抗體。專利技術概述提供了針對人組織因子途徑抑制劑(TFPI)的單克隆抗體。進一步提供了編碼其的分離的核酸分子。還提供了包含抗TFPI單克隆抗體的藥物組合物和治療遺傳性和獲得性凝固缺乏或缺陷諸如血友病A和B的方法。還提供了用于縮短出血時間的方法，其通過對有此需要的患者施用抗TFPI單克隆抗體進行。還提供了用于生成依照本專利技術的結合人 TFPI的單克隆抗體的方法。在一些實施方案中，已經優化提供的針對TFPI的單克隆抗體，例如以具有升高的親和力或升高的功能活性。附圖簡述圖I描繪的柱狀圖顯示了具有單個氨基酸取代的選擇的2A8變體，其使用dPT測定法在人血友病A血漿中在縮短凝固時間上顯示更多的效力。圖2描繪的圖顯示了選擇的單個氨基酸突變的抗TFPI抗體對抗因子VIII抗體誘導的人血友病血液的凝固時間的影響。圖3描繪的圖顯示了與親本4B7抗體相比且在更小程度上與2A8內的單個氨基酸取代相比，4B7-D62R在人抗體誘導的血友病A血液中在縮短凝固時間上具有多得多的效力。圖4描繪的兩幅圖顯示了與對照小鼠IgGl (CTX IgGl)相比以劑量依賴性方式用親本抗體2A8和具有多個氨基酸取代的2A8變體(本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王卓智，潘俊亮，J格魯德津斯卡，C沃特斯梅爾，J特貝，J伯肯菲爾德，N沃布斯特，S布呂克納，S施泰尼希，P肖爾茨，
申請(專利權)人：拜耳醫藥保健有限公司，
類型：
國別省市：
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