快速檢測(cè)煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法及其應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種快速檢測(cè)煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法及其應(yīng)用。田間煙粉虱的采集、預(yù)處理及研磨后，利用番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，建立檢測(cè)傳毒介體煙粉虱的dot-ELISA方法，并研發(fā)快速檢測(cè)試劑盒，對(duì)田間煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的情況進(jìn)行檢測(cè)。利用該發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)可對(duì)田間煙粉虱的帶毒率進(jìn)行大規(guī)模調(diào)查，預(yù)測(cè)田間番茄黃化曲葉病的流行爆發(fā)趨勢(shì)。該檢測(cè)方法快速高效、靈敏特異、高通量又操作簡(jiǎn)便，為番茄黃化曲葉病毒病的快速診斷、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及科學(xué)防控提供技術(shù)支撐。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)所屬的領(lǐng)域?yàn)樯?br>，尤其是涉及一種攜帶番茄黃化曲葉病毒的煙粉虱的快速檢測(cè)方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)屬于雙生病毒科(feOTifliririt/ae)菜豆金色花葉病毒屬Uiegomovirus、，該屬病毒在自然條件下只能由煙粉IS,(.Bemisia iaAaci)以持久方式傳播,因而又被稱(chēng)為粉風(fēng)傳雙生病毒。番爺黃化曲葉病害的大規(guī)模流行往往伴隨著傳毒介體煙粉虱的爆發(fā)。在我國(guó)，番茄黃化曲葉病最初僅分布在海南、云南、廣東和廣西等省，自2006年上海和浙江先后在番茄上發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒以來(lái)，該病害在華東地區(qū)迅速蔓延開(kāi)來(lái)，已在我國(guó)北京、上海、山東、新疆等18個(gè)省份的番茄上流行爆發(fā)。番茄黃化曲葉病導(dǎo)致番茄葉片上卷或下卷、葉片黃化、葉脈外突、植株矮化，嚴(yán)重時(shí)致番茄絕收。近年來(lái)，由于全球氣候變暖和農(nóng)業(yè)發(fā)展格局的變化，煙粉虱在我國(guó)北方地區(qū)也呈爆發(fā)趨勢(shì)，使得番茄黃化曲葉病害在我國(guó)自南向北迅速擴(kuò)散和蔓延開(kāi)來(lái)，對(duì)番茄生產(chǎn)構(gòu)成巨大威脅。番茄黃化曲葉病毒不能機(jī)械傳播，不經(jīng)卵傳播，只由煙粉虱成蟲(chóng)以持久性方式傳播，且煙粉虱一旦獲毒，即終身帶毒。煙粉虱傳毒效率高，每株植株上只要I頭帶毒B型或Q型煙粉虱成蟲(chóng)取食，則病毒傳毒率達(dá)50-55%，因此煙粉虱的爆發(fā)往往導(dǎo)致番茄黃化曲葉病害的大流行，在生產(chǎn)上造成巨大危害，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。實(shí)際生產(chǎn)中，田間煙粉虱是否攜帶番茄黃化曲葉病毒，帶毒率高低等問(wèn)題往往難以掌握。近年來(lái)我國(guó)番茄黃化曲葉病毒病發(fā)生處于上升時(shí)期，暴發(fā)態(tài)勢(shì)仍將延續(xù)，利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)提高我國(guó)對(duì)于番茄黃化曲葉病毒的早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警能力迫在眉睫。以往對(duì)于煙粉虱帶毒率的檢測(cè)只能依賴(lài)PCR的方法，而該方法受儀器依賴(lài)性強(qiáng)、成本高等限制只能檢測(cè)多頭煙粉虱的混合樣本，因而PCR方法得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)只是個(gè)粗略值，無(wú)法明確單頭煙粉虱的帶毒情況。另外，由于植物與昆蟲(chóng)的本質(zhì)區(qū)別使得適用于植物的血清學(xué)方法無(wú)法應(yīng)用到介體昆蟲(chóng)的檢測(cè)中。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速檢測(cè)煙粉虱體內(nèi)攜帶番茄黃化曲葉病毒的方法及其應(yīng)用。一種快速檢測(cè)煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法，包括如下步驟 O田間煙粉虱的采集、預(yù)處理及研磨； 2)硝酸纖維素(NC)膜準(zhǔn)備用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格1X1 cm,平整放入培養(yǎng)皿中央； 3)點(diǎn)樣吸取研磨的煙粉虱研磨液2μ ,點(diǎn)樣于NC膜的格子中央；4)封閉點(diǎn)樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5g脫脂奶粉加100 mL PBST緩沖液(含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)的比例配制得到5%的脫脂奶粉封閉，37°C靜置.O. 5-1小時(shí)； 5)加一抗加入中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1:2000倍稀釋?zhuān)?7°C孵育I小時(shí)； 6)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動(dòng)洗脫5次，每次3分鐘； 7)加酶標(biāo)二抗棄洗脫液，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(A4416Sigma), 二抗用5%的脫脂奶粉1:1000倍稀釋?zhuān)?7°C孵育I小時(shí)； 8)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動(dòng)洗脫5飛次，每次5分鐘； 9)顯色棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干，加入TMB顯色液(W4121Promega)顯色，避光靜置5 10分鐘； 10)終止反應(yīng)待NC膜上的樣品呈現(xiàn)藍(lán)色而陰性對(duì)照未顯色時(shí)棄顯色液終止反應(yīng)； 11)記錄結(jié)果ddH2O浸泡NC I吳，晚干后記錄結(jié)果。所述的田間煙粉虱的采集、預(yù)處理及研磨包括如下步驟 1)煙粉虱采集從大田中用吸蟲(chóng)器采集捕獲煙粉虱； 2)煙粉虱存放95%的酒精中室溫存放； 3)煙粉虱預(yù)處理移液槍吸掉95%的酒精，ddH20清洗3遍，去掉酒精； 4)煙粉虱研磨用毛筆蘸取單頭煙粉虱，置于干凈的封口膜上，室溫晾干5分鐘；晾干后，每頭煙粉虱滴加2 μ L 0.05 mol/L PBS緩沖液，用O. 5 mL離心管底磨碎至肉眼不能看到明顯組織。一種快速檢測(cè)煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒dot-ELISA試劑盒，包括以下步驟 1)試劑盒中主要試劑與材料 O.05 mol/L PBS10 ml單克隆抗體O. I ml HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗O. I ml TMB顯色底物液10 ml IOX濃縮封閉液10 ml IOX濃縮抗體稀釋液20 ml 20 X濃縮洗滌液60 ml封閉劑15 gNC膜5張 2)試劑盒操作步驟使用說(shuō)明 2. I)單頭煙粉虱置于封口膜上，加入2-3 ul O. 05 mol/L PBS，用0.5 ml離心管底磨碎； 2. 2)取2 ul上清點(diǎn)到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干燥10分鐘； 2. 3) NC膜浸入到含5%封閉劑的I X封閉液中室溫封閉30分鐘； 2. 4) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60分鐘； 2.5)IX洗滌液洗膜3-4次，每次3分鐘； 2.6)NC膜放入用I X抗體稀釋液1:1000倍稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中(A4416Sigma)室溫孵育30-60分鐘； 2.7)IX洗滌液洗膜5-6次，每次3分鐘； 2.8)用濾紙吸干膜后將TMB底物顯色液(W4121 Promega)滴加到膜表面進(jìn)行顯色反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果，待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)記錄檢測(cè)結(jié)果，顯色時(shí)間約5-20分鐘。所述的檢測(cè)煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA快速鑒定方法及其試劑盒的應(yīng)用，利用該方法對(duì)田間煙粉虱的帶毒情況進(jìn)行調(diào)查，精確計(jì)算煙粉虱帶毒率，預(yù)測(cè)番茄黃化曲葉病在田間的流行爆發(fā)趨勢(shì)以及時(shí)采取防治措施。本專(zhuān)利技術(shù)有益效果 1)本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種專(zhuān)門(mén)針對(duì)傳毒介體煙粉虱，快速檢測(cè)其體內(nèi)攜帶病毒的血清學(xué)方法; 2)本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種檢測(cè)煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的快速檢測(cè)試劑盒； 3)利用本專(zhuān)利技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)單頭煙粉虱帶毒情況的檢測(cè)，且精確性高； 4)本專(zhuān)利技術(shù)提供的鑒定方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，快速高效，檢測(cè)結(jié)果可靠； 5)本專(zhuān)利技術(shù)提供的試劑盒不依賴(lài)儀器、成本小、操作簡(jiǎn)便；可同時(shí)檢測(cè)幾百至幾千頭煙粉虱樣品，高通量又省時(shí)高效，適于在田間大規(guī)模推廣應(yīng)用； 6)利用本專(zhuān)利技術(shù)可對(duì)田間煙粉虱的帶毒情況進(jìn)行大規(guī)模調(diào)查，精確計(jì)算煙粉虱帶毒率，及時(shí)預(yù)測(cè)番茄黃化曲葉病在田間的流行爆發(fā)趨勢(shì)以及時(shí)采取防治措施。附圖說(shuō)明圖I田間米集的煙粉風(fēng)樣品； 圖2煙粉風(fēng)研磨示意 圖3部分田間煙粉虱樣品帶毒率檢測(cè)結(jié)果； 圖4檢測(cè)煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA試劑盒的外包裝； 圖5檢測(cè)煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA試劑盒的材料和試劑； 圖6應(yīng)用試劑盒檢測(cè)田間煙粉虱的帶毒情況。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)附圖和實(shí)施例對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例一田間煙粉虱樣品帶毒率檢測(cè) 本專(zhuān)利技術(shù)利用dot-ELISA的方法檢測(cè)田間煙粉虱對(duì)番茄黃化曲葉病毒的攜帶情況，計(jì)算煙粉虱帶毒率，預(yù)測(cè)當(dāng)?shù)胤腰S化曲葉病毒的爆發(fā)趨勢(shì)，以提早做好防治措施，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種快速檢測(cè)煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot？ELISA方法，其特征在于包括如下步驟：1）田間煙粉虱的采集、預(yù)處理及研磨；2）硝酸纖維素（NC）膜準(zhǔn)備：用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格1×1？cm，平整放入培養(yǎng)皿中央；3）點(diǎn)樣：吸取研磨的煙粉虱研磨液2？μL，點(diǎn)樣于NC膜的格子中央；4）封閉：點(diǎn)樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5？g脫脂奶粉加100？mL？PBST緩沖液的比例配制得到5%的脫脂奶粉封閉，37℃靜置0.5？1小時(shí)；所述的PBST緩沖液為含0.05%？Tween？20的0.01？mol/L？PBS；？5）加一抗：加入中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1:2000倍稀釋,？37℃孵育1小時(shí)；6）洗滌：棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動(dòng)洗脫5次，每次3分鐘；7）加酶標(biāo)二抗：棄洗脫液，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脫脂奶粉1:1000倍稀釋?zhuān)?7℃孵育1小時(shí)；8）洗滌：棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動(dòng)洗脫5~6次，每次5分鐘；9）顯色：棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干，加入TMB顯色液顯色，避光靜置5~10分鐘；10）終止反應(yīng)：待NC膜上的樣品呈現(xiàn)藍(lán)色而陰性對(duì)照未顯色時(shí)棄顯色液終止反應(yīng)；11）記錄結(jié)果：ddH2？O浸泡NC膜，晾干后記錄結(jié)果。...

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：謝艷，周雪平，吳建祥，矯曉陽(yáng)，劉歡，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：