本發明專利技術涉及一株嗜熱脫氮芽孢桿菌正烷烴末端降解途徑中的嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶的晶體結構。本發明專利技術利用大腸桿菌E.coli異源表達該醇脫氫酶。通過蛋白質純化方法獲得該酶的純品。利用懸滴結晶法得到該酶適宜衍射的晶體。利用X射線衍射方法對該酶的晶體結構進行解析。結果表明，一個亞基中含有兩個結構域，其被一個裂縫隔開。N-端結構域含有一對類似于羅斯曼折疊的α/β折疊。該結構域含有一個NAD+輔酶結合位點。C-端結構域含有一個脫氫奎尼酸鹽合成酶類似的α結構域布局。一個金屬鐵離子結合到C-端結構域，并暴露于中間裂縫。這些結果能全方位反應該酶的空間構象，為進一步研究醇脫氫酶的結構與功能之間的關系、提高酶的降解活性提供理論上的指導。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及到用X射線晶體衍射方法確定的一種嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶晶體結構，屬于分子生物學和應用微生物學領域。
技術介紹
醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADHs, EC I. I. I. I)是生物體內重要的氧化還原劑之一，很多醇類代謝都是通過醇脫氫酶催化完成的。在動物、植物、微生物、真核生物以及原核細菌中都已發現醇脫氫酶，至少有25個EC編號的酶被稱為醇脫氫酶。醇脫氫酶能夠催化醇類物質到醛類物質的可逆氧化。ADHs的底物范圍很廣，其所起到的生理學作用也是多種多樣的。在微生物烷烴類物質的末端降解途徑中，ADHs催化反應中的第二步，末端降解途徑如圖3所示。 在正烷烴類物質末端降解途徑中，由烷烴加氧酶將烷烴氧化為長鏈烷醇，再由醇脫氫酶進一步脫氫為長鏈烷醛，生成的長鏈烷醛在醛脫氫酶的作用下脫氫生成長鏈脂肪酸。在長鏈脂肪酸輔酶A連接酶作用下生成長鏈烷酸輔酶A后進入三羧酸循環，最終完全氧化為二氧化碳和水。醇脫氫酶來源廣泛，種類繁多。依賴NAD(P)H的醇脫氫酶，根據它們的分子性質和金屬含量，能夠分為三類。I型Zn2+依賴的長鏈醇脫氫酶(每個亞基含有約350個氨基酸殘基)，如來自于大腸桿菌Escherichia coli的菌株K_12中的YqhD。II型不含有金屬的短鏈醇脫氫酶(每個亞基中含有約250個氨基酸殘基),如來自于棲熱菌屬的ThermusthermophiIus HB27中的醇脫氫酶即屬于該型脫氫酶。III型含鐵的/由鐵激活的長鏈醇脫氫酶(每個亞基中含有385-900個氨基酸殘基)，如來自于發酵單胞菌屬的Zymomonasmobilis ZM4中的醇脫氫酶,該醇脫氫酶需要鐵離子存在才能活化發揮功能，以及來自于大腸桿菌E. coli的菌株ECLl中的含鐵的醇脫氫酶。不動桿菌屬中菌株HOlN對于十六烷醇具有降解活性。從一些已知的烷烴降解細菌，如假單胞菌屬 Pseudomonas fluorescens NRRL B-1244、假單胞菌屬 PseudomonasbutanovoraATCC 43655、不動桿菌屬Acinetobacter M-1,以及一些尚未了解具有降解經類物質功能的細菌，如土壤芽孢桿菌屬Geobacillus stearothermophiIus LLD-R、熱球菌屬Pyrococcusfuriosus DSM 3638,以及黃桿菌屬 Flavobacterium frigidimaris KUC-1,等菌株都表現出了對于短鏈長到中等鏈長(C2-C14)烷基醇的降解活性。然而，具有降解較長鏈長(C15及以上)烷基醇的醇脫氫酶到目前還沒有報道。目前研究最為清楚的是酵母菌中的醇脫氫酶，其為四聚體，單個亞基肽鏈含有347個氨基酸殘基，亞基分子量為35000。酵母醇脫氫酶對底物專一性強，對乙醇及其他直鏈伯醇活性較高，只對少數仲醇和側鏈烷醇具有活性。在石油烴降解途徑中，嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrificans)NG80-2中的長鏈烷醇醇脫氫酶是十分重要的關鍵酶，其能夠耐高溫并高效利用烷烴單加氧酶的催化產物長鏈烷醇，使其進一步脫氫，提高烷烴降解途徑中的催化效率；另一方面，它有著比長鏈烷烴單加氧酶更廣泛的底物范圍，不僅能夠催化長鏈烷醇，還對短鏈醇有很高的催化能力。因此，對長鏈烷醇醇脫氫酶的研究不僅有利于深入了解嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrif icans) NG80-2降解長鏈燒烴途徑的機制,為探索其它燒烴降解菌的代謝途徑提供理論基礎，對該酶構建高效表達工程菌株及大量純化更具有廣闊的工業應用前景和經濟價值。經文獻檢索，未發現與本專利技術的嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶的晶體結構相同的公開文獻報道。
技術實現思路
本專利技術目的是為了更加深入了解嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrif icans) NG80-2中參與正燒烴末端降解途徑中的嗜熱長鏈燒醇醇脫氫酶的 結構與功能之間的關系，提供嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶的晶體結構；本專利技術通過蛋白質表達、純化和懸滴氣相擴散結晶方法獲得了該嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶的晶體，并通過X射線衍射方法對醇脫氫酶的晶體結構進行了解析。本專利技術中涉及的嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶，其可以廣泛作用于C12-C3tl之間的長鏈烷醇，其底物范圍為碳鏈長度大于16個碳原子的烷基醇、1，3_丙二醇、乙醛、異丙醇、異戊醇、丙酮、辛醛和癸醛。其中，該醇脫氫酶的最適底物為I-辛醇。該醇脫氫酶可以利用NAD+/NADP+作為輔因子。序列分析該醇脫氫酶屬于III型醇脫氫酶。在石油烴降解途徑中，長鏈烷醇醇脫氫酶是十分重要的關鍵酶，對該酶的研究為深入研究嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrif icans )NG80_2降解長鏈燒烴代謝途徑的機制提供了更有利的證據，也為探索其它烷烴降解菌的代謝途徑提供理論基礎。同時，該酶的嗜熱性及降解長鏈烷醇的能力具有重要的工業應用價值，可以應用于石油污染物和石油廢水的處理過程及用于提高微生物石油采收率。本專利技術通過X射線衍射方法，確定嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrif icans) NG80-2中參與正燒烴末端降解途徑中的嗜熱長鏈燒醇醇脫氫酶的晶體結構。為進一步研究該醇脫氫酶的降解機理、理解其結構與功能之間的關系，及將該酶用于環境石油污染治理中提供理論上的指導。本專利技術所涉及的菌株為嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrif icans)NG80-2，該菌株于2004年10月09日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC No. 1228，該菌株已公開在專利號為ZL200410072759. 7、專利技術名稱為《嗜熱脫氮芽孢桿菌及其篩選和應用》的中國專利技術專利中。本專利技術提供的嗜熱脫氮芽孢桿菌內的嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶，其晶體結構如下一個亞基中含有兩個結構域，這兩個結構域被一個裂縫隔開。N-端結構域含有一對類似于羅斯曼折疊的α/β折疊，其中包含β折疊1-5和β折疊8，α螺旋1_4位于側面；該結構域含有一個NAD+輔酶結合位點。C-端結構域含有一個脫氫奎尼酸鹽合成酶類似的α結構域布局，其中9個α螺旋排成了一個螺旋束。一個金屬鐵離子結合到C-端結構域，并暴露于中間裂縫。該金屬鐵離子處于由四個嚴格保守的殘基Aspl94，Hisl98，His261和His267所構成的金字塔形式的氫鍵網絡之中。上述的醇脫氫酶的活性中心結構特征為在N-端結構域和C-端結構域中間有一條裂縫，有一個通道通往該裂縫。這個裂縫為底物提供了一個入口，并且使其能夠接觸到NAD+輔酶和金屬結合位點。然而，該長鏈烷醇醇脫氫酶在之前的功能研究中并未表明其需要鐵來使其發揮活性(Liu et al. , 2009, Microbiology 155:2078-85)。本專利技術所述的嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶的晶體結構，經如下步驟得到I、蛋白酶的表達將含有該醇脫氫酶基因的重組質粒的大腸桿菌E. coli的菌液，接種到5ml經過滅菌且添加100mg/l kanamycin抗生素的LB液體培養基中,在37°C搖床中過夜培養1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株嗜熱脫氮芽孢桿菌內的嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶，其特征在于該嗜熱長鏈烷醇醇脫氫酶的晶體結構如下：其空間群為C2221，晶胞參數為α=β=γ=90°；其為二聚體，一個亞基中含有兩個結構域，這兩個結構域被一個裂縫隔開；N？端結構域含有一對羅斯曼折疊類似的α/β折疊，其中包含β折疊1？5和β折疊8，α螺旋1？4位于側面，N？端結構域含有一個NAD+輔酶結合位點；C？端結構域含有一個脫氫奎尼酸鹽合成酶類似的α結構域布局，其由9個α螺旋排成了一個螺旋束，一個金屬鐵離子結合到C？端結構域，并暴露于中間裂縫，該金屬離子處于由四個嚴格保守的殘基Asp194、His198、His261和His267所構成的金字塔形式的氫鍵網絡之中。FDA00002555442400011.jpg
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：馬克·巴特蘭姆，王瑩瑩，紀玉蕊，
申請(專利權)人：南開大學，
類型：發明
國別省市：
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