本發明專利技術公開了一種發酵生產葡萄糖氧化酶酶活的方法，屬于發酵工程領域。本發明專利技術采用本實驗室在前期工作中構建的可以產較高活性葡萄糖氧化酶的重組畢赤酵母Pichia?pastorisGS115-pPIC9K-GOX基因工程菌，保藏編號為CCTCC?NO：M?2012266。在甲醇誘導階段通過添加山梨醇來提高葡萄糖氧化酶的酶活:即控制發酵液中甲醇殘留濃度1.8%(W/V)，且甲醇與山梨醇混合添加比例為10:1(W/W)時，葡萄糖氧化酶的酶活為645.3U/mL，比不添加山梨醇(427.6U/mL)提高了50.9%，而且有效縮短了發酵周期，這為葡萄糖氧化酶的大規模生產奠定了良好的基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及，屬于遺傳工程領域。
技術介紹
葡萄糖氧化酶(β-D-glucose:oxygenl-oxidoreductase;EC I. I. 2. 3. 4,簡稱GOD)，是一種富含糖基的黃體蛋白，它能夠在有氧氣的條件下專一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。葡萄糖氧化酶(GOD)是生物領域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應用于血糖測定以來，GOD被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等許多相關領域。 在食品工業中，由于氧的存在，引起許多不利于產品質量的化學反應，并為許多微生物生長創造了條件。目前，許多國家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量，指導生產。在醫藥工業中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發生。此外，由于可以催化生成過氧化氫，還可用于對過氧化氫敏感的淋巴瘤的導向目標的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環境，調節飼糧消化，促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進動物生長作用。GOD廣泛地分布于動物、植物和微生物體內，但由于微生物具有生長繁殖速度快，來源廣等特點使之成為葡萄糖氧化酶的主要來源。從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細菌GOD產酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS資格)和青霉屬菌株作為GOD生產菌。產量低、酶活低、檢測方法復雜是GOD產業化的限制性因素。葡萄糖氧化酶大規模生產廣泛采用黑曲霉或青霉發酵，但青霉和黑曲霉發酵產生過氧化氫酶，纖維素酶，淀粉酶等其他多種副產物，大量的雜蛋白對后期的分離純化工作造成很大的困難，也增加了生產成本。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供，以一種產葡萄糖氧化酶的基因工程菌為生產菌株，保藏編號為CCTCC NO M 2012266，于2012年7月3日保藏于中國典型培養物保藏中心；其特征在于將活化后YH)擴培的菌液接入全自動發酵罐中的發酵培養基進行發酵處理，接種量為10%，以25%氨水控制pH 5. 5，溫度30°C，調節攪拌轉速和通氣量維持溶氧30%以上；當甘油耗盡DO迅速上升時，開始流加50%甘油補料生長培養基，當菌體干重達到100g/L后，停止補料；待甘油再次耗盡，繼續保持基質匱乏狀態約Ih后，開始流加誘導培養基，誘導條件為溫度降低至20-25°C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1-5:1 (W/W)，并且維持整個誘導過程的甲醇濃度為I. 5-2. 5%(W/V)，誘導葡萄糖氧化酶表達。誘導條件優選溫度降低至22°C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1 (ff/W)，并且維持整個誘導過程的甲醇濃度為1.8%(w/v)，誘導葡萄糖氧化酶表達。所述發酵培養基組成為(IL):85% 磷酸 26. 7mL/L，CaS04 O. 93g/L, K2SO4 18. 2g/L, MgSO4 · 7H20 14. 9g/L, KOH 4. 13g/L,甘油 40. Og/L, PTM1 4. 35mL/L, 25% 氨水調 pH 5. 5 ；其中 PTM1 (IL)組成為CuS04, 6. 0g; KI, 0. 08g;MnSO4, 3. 0g; Na2MoO4, 0. 2g; H3BO3, 0. 02g;CoCI2, 0. 5g;ZnCl2, 20. Og;FeSO4 · 7H20, 65. 0g;biotin, 0. 2g;and 98%(w/w)H2SO4, 5mL。 所述補料生長培養基50%(W/V)甘油，其中含12mL/L PTM10所述發酵誘導培養基組成為100%甲醇，其中含12mL/L PTM1與山梨醇其中含12mL/L PTM1 混合之比為 10 :1 (W/W)。葡萄糖氧化酶的酶活測定方法G0D活性測定一般采用鄰-聯(二)茴香胺分光光度法。在有氧條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產生H2O2，在過氧化物酶(POD)作用下，氧供體鄰-聯(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產物。測540nm處吸光度的變化，根據標準曲線的結果，計算葡萄糖氧化酶活力單位。本專利技術的有益效果該菌株表達的葡萄糖氧化酶在3L發酵罐上酶活為645. 3U/mL,比不添加山梨醇(427. 6U/mL)提高了 50. 9%，大大提高了酶活，這為葡萄糖氧化酶的高效生產奠定了良好的基礎。生物材料保藏一株產葡萄糖氧化酶的基因工程菌，該菌株為巴斯德畢赤酵母，命名為PichiapastorisGS115-pPIC9K-G0X，在專利申請號為201210349289. 9的專利申請中已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M 2012266，保藏日期為2012年7月3日。附圖說明圖I :誘導階段山梨醇的添加對GOD酶活的影響。圖2 :誘導階段山梨醇的添加對生物量的影響。圖3 :誘導階段山梨醇的添加對GOD比酶活的影響。具體實施例方式實施例I重組菌的3L發酵罐發酵以本實驗室前期工作中構建的Pichia pastoris GS115-pPIC9K_G0X為生產菌株，活化后，挑單菌落，接種于50mL YPD中(50mL培養基/500mL三角瓶)，并于30°C、200r/min培養24h。將YPD中菌液接入3L全自動發酵罐(LiFlusGM BioTRON，Korea)，接種量為10%，以25%氨水控制pH 5. 5，溫度30°C，調節攪拌轉速和通氣量維持溶氧30%以上。當甘油耗盡(D0迅速上升)時，開始流加50%甘油補料生長培養基。當菌體達到100g/L后，停止補料。待甘油再次耗盡，繼續保持基質匱乏狀態約Ih后，開始流加誘導培養基，把誘導溫度降低至22°C，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1 (W/W)并且維持整個誘導過程甲醇濃度為I. 8%(W/V)，誘導葡萄糖氧化酶表達。培養基I)種子和斜面培養基為YPD培養基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g ;斜面培養基添加瓊脂20g ；2)分批發酵培養基 BSM (1L) 85% 磷酸 26. 7mL/L, CaS04 O. 93g/L, K2S04 18. 2g/L, MgS04 · 7H20 14. 9g/L, KOH 4. 13g/L,甘油 40. Og/L, PTM1I 35mL/L, 25% 氨水調 pH 5. 5。3) PTM1 (1L) CuSO4, 6. Og; KI, 0. 08g;MnSO4, 3. Og; Na2MoO4, 0. 2g; H3BO3, 0. 02g; CoCl2, 0. 5g;ZnCl2, 20. Og;FeSO4 · 7H20, 65. 0g;biotin, 0. 2g;and 98%(w/w)H2SO4, 5ml4)補料生長培養基50% (W/V)甘本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種發酵生產葡萄糖氧化酶的方法，以一種產葡萄糖氧化酶的基因工程菌為生產菌株，保藏編號為CCTCC？NO：M？2012266，于2012年7月3日保藏于中國典型培養物保藏中心；其特征在于將活化后YPD擴培的菌液接入全自動發酵罐中的發酵培養基進行發酵處理，接種量為10%，以25%氨水控制pH？5.5，溫度30℃，調節攪拌轉速和通氣量維持溶氧30%以上；當甘油耗盡DO迅速上升時，開始流加50%甘油補料生長培養基，當菌體干重達到100g/L后，停止補料；待甘油再次耗盡，繼續保持基質匱乏狀態約1h后，開始流加誘導培養基，誘導條件為：溫度降低至20？25℃，控制甲醇和山梨醇的混合添加比例為10:1？5:1（W/W），并且維持整個誘導過程的甲醇濃度為1.5？2.5%(W/V)，誘導葡萄糖氧化酶表達。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：張娟，陳堅，顧磊，堵國成，沈伊娜，李婷，李夢潔，殷政，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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