一種增強間充質干細胞免疫抑制功能的方法技術

本發明專利技術涉及細胞治療技術領域間充質干細胞技術領域，特別涉及一種增強間充質干細胞免疫抑制功能的方法，將分離的間充質干細胞傳代培養后，用含有IFN-γ、IL-1β和黃體酮的培養基培養。經過IFN-γ、IL-1β和黃體酮共培養激活后，MSC細胞對淋巴細胞增殖的抑制率提高了2-7倍，MSC細胞內免疫抑制蛋白的表達提高了2-12倍，細胞分泌抗炎因子的能力提高了5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了10%-30%，MSC細胞的免疫抑制活性大為增加。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及細胞治療
間充質干細胞
，特別涉及。技術背景間充質干細胞(Mesenchymal stem cell,MSC)是中胚層起源的，能夠進行自我更新,并具備向成骨、軟骨和脂肪細胞分化潛能的一種成體干細胞。因為MSC易于分離培養，增殖能力強，免疫原性較低，且來源廣泛不存在倫理學問題，這使其在細胞治療方面的應用具備了其他干細胞所沒有的優勢。MSC不僅具有低免疫原性，還具有調節免疫功能的作用。MSC不僅可以通過抑制樹突狀細胞的成熟和抑制T淋巴細胞，B淋巴細胞以及NK細胞的免疫功能抑制免疫反應，還能分泌多種因子調節免疫系統形成免疫抑制。間充質干細胞的免疫抑制功能使間充質干細胞成為一種良好的生物免疫抑制劑，可以用于器官移植抗排斥反應和自身免疫病如類風濕性關節炎、紅斑狼瘡、硬皮病、膜腎球腎炎、炎性腸病和自身免疫性溶血貧血等。但間充質干細胞的免疫抑制療法需要較大的細胞量才能起到作用，回輸大劑量的間充質干細胞可能會產生急性肺栓塞，肝栓塞，腎栓塞，發熱，皮疹等副作用，因此如果能提高單個細胞 的免疫抑制能力，在較少細胞量的情況下，間充質干細胞就能起到充分的免疫抑制作用，在提高細胞治療效力，減少不良副反應，降低治療成本等方面具有重要意義
技術實現思路
為了解決以上間充質干細胞的免疫抑制能力較低、需要較大的細胞量才能起作用的問題，本專利技術提供了一種通過MSC免疫調節過程中的關鍵蛋白的上調來增強間充質干細胞免疫抑制功能的方法。本專利技術是通過以下方式實現的，將分離的間充質干細胞傳代培養，用含有培養因子的培養基培養至細胞70%匯合，再更換溶有IFN- Y、IL-I β和黃體酮的培養基培養。所述的方法，優選溶有IFN- Y、IL-I β和黃體酮的培養基中含有l_600ng/mL的 IFN- Y U-200ng/mL 的 IL-1 β 和 1-100 μ g/mL 的黃體酮。所述的方法，優選溶有IFN-Y、IL-I β和黃體酮的培養基中含有50ng/mL的 IFN- Y、20ng/mL 的 IL-1 β 和 10 μ g/mL 的黃體酮。所述的方法，優選含有培養因子的培養基中含有EGF l-50ng/mL、FGF l_50ng/mL、 VEGF l-50ng/mL和 PDGF l_50ng/mL。所述的方法，優選含有培養因子的培養基中含有EGF 2ng/mL、FGF 2ng/mL、VEGF 2ng/mL 和 PDGF 2ng/mL。所述的方法，優選含有培養因子的培養基和溶有IFN- Y、IL-I β和黃體酮的培養基中均含10% (體積比)的胎牛血清和2mM/mL的谷氨酰胺。所述的方法，優選含有培養因子的培養基和溶有IFN- Y、IL-I β和黃體酮的培養基的基礎培養基均為DMEM/F12。3所述的方法，優選取傳代2-5代的間充質干細胞，培養24-48小時，使其達到70%匯合。所述的方法，優選間充質干細胞在溶有IFN-Y、IL-I β和黃體酮的培養基中培養2-5天后，棄培養基，收獲免疫抑制功能增強的間充質干細胞。所述的方法，優選所述間充質干細胞為人類新生兒臍帶間充質干細胞。通過一些細胞因子和生物分子來刺激MSC細胞表面受體，通過分子通路激活內源基因，上調細胞免疫抑制蛋白的表達和免疫抑制活性物質的分泌，能達到增強MSC免疫抑制功能的效果。Y干擾素(IFN- Y )、白介素I β (IL-I β )和黃體酮不僅能增強MSC對T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞的接觸抑制，還可以激活MSC內源基因，增加細胞釋放的免疫抑制活性物質。細胞因子激活是在不影響MSC細胞內在基因構成，保證生物安全性的基礎上提高MSC免疫抑制功能的最好方法。IFN- Y ,IL-I β和黃體酮三種因子聯合激活MSC細胞，對于活化不同位置的內源基因，促進多種不同免疫抑制蛋白的分泌起到了強化高效的協同誘導作用。Y干擾素等細胞因子與MSC表面的受體結合后，通過JAK/STAT信號通路調控細胞核內染色體上相應基因的表達，上調細胞表面蛋白和免疫抑制活性物質的分泌，增強MSC 的免疫抑制功能。因子與靶受體結合，使受體的單鏈形成二聚體，連接受體的JAK蛋白彼此接近并相互磷酸化激活自己。JAK蛋白一旦被激活，就會磷酸化因子受體的細胞內部分，創建一個細胞質內STAT蛋白可以停靠的區域，STAT—旦與其結合，它的氨基酸順序上的一個酪氨酸殘基就被JAK磷酸化，從而STAT蛋白被激活。磷酸化的STAT形成二聚體并從受體上脫離下來，轉位到細胞核作為轉錄因子識別特定的DNA序列，上調免疫抑制蛋白的表達。本專利技術的有益效果(1)本專利技術使用多種細胞因子聯合激活細胞表面的受體，活化MSC內源基因，上調免疫抑制蛋白和分泌性因子的產量，不僅可以增強MSC對免疫系統樹突狀細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞的接觸抑制，還可以通過調節炎性因子的濃度使局部的免疫反應進一步減弱；(2)Y干擾素等因子副作用小，成本低，激活細胞受體的效率高，是MSC細胞免疫調節的有效輔助劑；(3)經過IFN-Y ,IL-I β和黃體酮共培養激活后，MSC細胞對淋巴細胞增殖的抑制率提高了 2-7倍，MSC細胞內免疫抑制蛋白的表達提高了 2-12倍，細胞分泌抗炎因子的能力提高了 5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了 10%-30%，MSC細胞的免疫抑制活性大為增加。附圖說明圖I為實施例I得到的MSC參與混合淋巴細胞反應淋巴細胞增殖抑制率對比圖，圖2為實施例I得到的MSC免疫抑制蛋白表達上調情況圖，圖3為實施例I得到的MSC分泌抗炎因子和促炎因子的變化情況，圖4為實施例2得到的MSC參與混合淋巴細胞反應淋巴細胞增殖抑制率對比圖，圖5為實施例2得到的MSC免疫抑制蛋白表達上調情況圖，圖6為實施例2得到的MSC分泌抗炎因子和促炎因子的變化情況，圖7為實施例3得到的MSC參與混合淋巴細胞反應淋巴細胞增殖抑制率對比圖，圖8為實施例3得到的MSC免疫抑制蛋白表達上調情況圖，圖9為實施例3得到的MSC分泌抗炎因子和促炎因子的變化情況，各圖中的“+因子”代表使用含有IFN-Y、IL-I β、黃體酮為培養因子的培養基培養后得到的MSC。具體實施方式下面結合具體實施實例對本專利技術進行進一步描述，但本專利技術的保護范圍并不僅限于此。實施實例I :I、增強MSC的免疫抑制功能臍帶間充質干細胞的提取使用經產婦同意授權的新生兒臍帶作為間充質干細胞的來源。將新生兒臍帶在含1% 雙抗的生理鹽水中洗滌三次，去除表面的血污，然后剪成約I厘米長的小段。用眼科剪將臍帶沿血管平行方向縱向剖開，將2根臍動脈和I根臍靜脈血管從臍帶中剝離干凈。剩余華通膠部分用含1%雙抗的生理鹽水充分洗滌3次，剪碎至約Imm3大小。將剪碎的組織塊均勻的平鋪在75cm2培養瓶內，加入5mL培養基，放置在37°C，5% CO2的培養箱內培養5-10天。培養基成分為DMEM/F12 (Hyclone)中加入10% (體積)FBS (胎牛血清，購自 Gibco)、2mM 谷氨酰胺(Sigma)、2ng/mL FGF(R&D)、2ng/m L EGF(R&D)、2ng/ mL VEGF (R&D)和2ng/mL PDGF (R&D)。每隔三天更換一次培養基，細胞長本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種增強間充質干細胞免疫抑制功能的方法，其特征是將分離的間充質干細胞傳代培養，用含有培養因子的培養基培養至細胞70%匯合，再更換溶有IFN？γ、IL？1β和黃體酮的培養基培養。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉小盾，李棟，
申請(專利權)人：山東省齊魯干細胞工程有限公司，
類型：發明
國別省市：