本發(fā)明專利技術(shù)涉及血清miRNA用于檢測(cè)膀胱癌的生物標(biāo)志物，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供膀胱癌患者血清中循環(huán)miRNA標(biāo)志物，建立膀胱癌患者血循環(huán)miRNA表達(dá)譜，揭示了血清miRNA對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值，為臨床上膀胱癌患者的早期發(fā)現(xiàn)及早期治療提供支持。本發(fā)明專利技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)血清miRNA尤其是miR-663b和miR-497作為一個(gè)重要的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，在膀胱癌臨床早期診斷、鑒別診斷、有效觀察中的作用，為今后泌尿系統(tǒng)腫瘤血清miRNA的研究提供了理論依據(jù)，并為從分子水平診斷膀胱癌提供了新的思想，具有重大的理論意義和潛在的實(shí)用價(jià)值。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物技術(shù)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及膀胱癌的血清miRNA生物標(biāo)志物的檢測(cè)方法及表達(dá)量的檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
膀胱癌是一個(gè)重要的公共問(wèn)題，在世界范圍內(nèi)，膀胱癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第四位，是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。臨床上，膀胱鏡檢查及尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)仍是當(dāng)前診斷膀胱癌不可替代的金標(biāo)準(zhǔn)，但是膀胱鏡檢查會(huì)帶給患者創(chuàng)傷和昂貴的檢測(cè)費(fèi)用，而細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性低。所以，膀胱癌的分子生物學(xué)研究日益受到國(guó)內(nèi)外的重視，希望從分子水平上揭示膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)歸，從而提高膀胱癌的診治水平。近幾年來(lái)，大量研究資料表明，多種微小RNA(microRNA，miRNA)參與了腫瘤細(xì)胞的生物調(diào)控過(guò)程，間接發(fā)揮著癌基因和抑癌基因的功能，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起了至關(guān)重要的作用。miRNAs是一類在生物體中廣泛存在的進(jìn)化上保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，其長(zhǎng)度約為21nt，能夠與靶基因mRNA的3’ -UTR區(qū)特異性堿基配對(duì)，從而導(dǎo)致靶基因的降解或抑制其翻譯，影響靶基因的產(chǎn)物生成，主要參與基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。目前，關(guān)于miRNA與膀胱癌的研究已經(jīng)展開，并在不斷深入。幾個(gè)基于芯片技術(shù)和生物信息學(xué)的研究已發(fā)現(xiàn)一些與膀胱癌密切有關(guān)的miRNA。近幾年的研究均顯示，miRNA在組織和細(xì)胞中的表達(dá)表現(xiàn)為顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性。但是，由于腫瘤標(biāo)本來(lái)源的限制，使得組織miRNA在臨床上的應(yīng)用存在一定局限性。而外周血標(biāo)本的獲得卻十分簡(jiǎn)便，如果能在血液中檢出癌癥特異性的miRNA并將其作為癌癥的生物學(xué)標(biāo)志，對(duì)于早期診斷癌癥具有至關(guān)重要的意義。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在外周血中的表達(dá)同樣具有腫瘤相關(guān)性和組織特異性，外周血miRNA可能成為理想的腫瘤標(biāo)志物。miRNA在血液中可長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，RNA酶降解，煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境、長(zhǎng)期保存等各種處理方法均不會(huì)造成血清miRNA的損失。正是血清miRNA良好的穩(wěn)定性，為循環(huán)miRNA的檢測(cè)，以及它在科學(xué)研究和臨床上的應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。循環(huán)miRNA作為腫瘤的標(biāo)志物具有廣泛的應(yīng)用前途。它具有檢測(cè)的損傷小、靈敏度高等特點(diǎn)，還可以應(yīng)用于腫瘤的早期診斷，理論上甚至可以在正常細(xì)胞惡變的過(guò)程當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于至今缺乏明確腫瘤標(biāo)志物的許多實(shí)體腫瘤來(lái)說(shuō)，具有良好的臨床應(yīng)用前景。但是目前這種檢測(cè)還有很多缺點(diǎn)和不足。由于血液中miRNA的表達(dá)量較低，對(duì)檢測(cè)試驗(yàn)的條件要求很高。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在許多腫瘤患者的血清中檢測(cè)出表達(dá)異常的miRNA。但還沒(méi)有膀胱癌病人血清的相關(guān)研究和開發(fā)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供膀胱癌患者血清中循環(huán)miRNA標(biāo)志物，建立膀胱癌患者血循環(huán)miRNA表達(dá)譜，揭示了血清miRNA對(duì)膀胱癌的診斷價(jià)值，為臨3床上膀胱癌患者的早期發(fā)現(xiàn)及早期治療提供支持。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)所涉及的膀胱癌血清miRNA檢測(cè)及表達(dá)譜的建立方法，包括以下步驟(1)用QIANGEN試劑盒從膀胱癌患者和正常人對(duì)照的血清中提取總RNA，通過(guò)TaqMan低密度芯片TLDA篩選出候選miRNA ；(2)米用TaqManprobe-based qRT_PCR方法,擴(kuò)大樣本量對(duì)候選miRNA進(jìn)行驗(yàn)證,建立膀胱癌血清miRNA表達(dá)譜。進(jìn)一步的，米用ROC (receiver operator characteristic curve)分析方法評(píng)價(jià)血清miRNA表達(dá)譜對(duì)于膀胱癌患者的早期診斷以及不同臨床分級(jí)、分期的膀胱癌患者的診斷價(jià)值。所述的膀胱癌的血清miRNA生物標(biāo)志物在制備膀胱癌檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本專利技術(shù)還涉及檢測(cè)膀胱癌血清miRNA的穩(wěn)定內(nèi)參，比較內(nèi)源性內(nèi)參U6和mir_16在膀胱；癌患者血清中表達(dá)的穩(wěn)定性，其方法是(I)以外源性的cel-mir_39為內(nèi)參，隨機(jī)選擇24例病例和匹配的24例對(duì)照血清，分別檢測(cè)U6和mir-16在病例和對(duì)照中的表達(dá)是否存在差異；(2)隨機(jī)選擇3個(gè)病例，每個(gè)等分成4份，分別暴露于室溫下0、l、2、4h后提取總RNA,比較同一樣本在不同暴露時(shí)間下，U6和mir-16的表達(dá)是否存在差異。本專利技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)血清miRNA作為一個(gè)重要的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，在膀胱癌臨床早期診斷、鑒別診斷、有效觀察中的作用，為今后泌尿系統(tǒng)腫瘤血清miRNA的研究提供了理論依據(jù)，并為從分子水平診斷膀胱癌提供了新的思想，具有重大的理論意義和潛在的實(shí)用價(jià)值。附圖說(shuō)明下面結(jié)合附圖和本專利技術(shù)的實(shí)施方式進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明圖I :不同暴露時(shí)間下U6和miR-16在血清中表達(dá)的穩(wěn)定性；圖2 miRNA在10對(duì)膀胱癌病例對(duì)照中的表達(dá)；圖3 :血清miR-663b和miR-497在膀胱癌病例和對(duì)照中的表達(dá)水平；圖4 =ROC曲線分析圖。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本專利技術(shù)技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本專利技術(shù)的包含范圍不限于下述的實(shí)施例，下面的實(shí)施例中未注明的條件和方法等均按照常規(guī)或者制造廠商所建議的條件進(jìn)行。I、樣本收集和RNA提取收集56例新發(fā)膀胱癌病例，同時(shí)收集60例在年齡和性別上相匹配的對(duì)照。病例主要于醫(yī)院收集的經(jīng)過(guò)病理診斷病例。對(duì)照來(lái)自于健康非腫瘤病人。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，并提供200uL血清。隨機(jī)抽取10對(duì)年齡性別匹配的病例和對(duì)照，用QIANGEN試劑盒提取血清中總RNA做TaqMan低密度芯片(TLDA)，以芯片中ath-mir_159a和mir-16為內(nèi)參，以Λ Λ CT絕對(duì)值大于5為標(biāo)準(zhǔn)，選出7個(gè)表達(dá)有差異的miRNA，同時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選出miR-1作為候選miRNA與芯片篩選的7個(gè)miRNA —起進(jìn)行大樣本的驗(yàn)證。2、樣本的流行病學(xué)調(diào)查和臨床資料所有病人都經(jīng)過(guò)兩名病理醫(yī)生的病理診斷，納入本研究前未患其它腫瘤，且未經(jīng)放射或化學(xué)藥物治療。病例和隊(duì)長(zhǎng)都使用統(tǒng)一的健康狀況調(diào)查表，以面對(duì)面的方式對(duì)病例和對(duì)照進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括一般人口學(xué)特征、吸煙史、飲酒史、飲食、個(gè)人史和家族史等。吸煙者定義為每天吸煙超過(guò)I支并持續(xù)一年以上，累計(jì)吸煙量“包年”按(每日吸煙量/20) X吸煙年數(shù)來(lái)計(jì)算。飲酒者定義為每周至少3次，持續(xù)一年以上。所有調(diào)查人員均經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)。3、血清miRNA表達(dá)量的檢測(cè)方法米用TaqMan probe-based qRT-PCR檢測(cè)血清中miRNA的表達(dá)量(I)逆轉(zhuǎn)錄采用TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop)逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體操作參照ABI的流程，其中部分進(jìn)行調(diào)整，反應(yīng)體系包括3uL 5*的逆轉(zhuǎn)錄弓I物(同時(shí)加入5個(gè)逆轉(zhuǎn)錄弓I物，每次包含內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄弓丨物)、I. 5uL10*的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、O. 15uL IOOmmoI/L的dNTP和dTTP混合物、IuL逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/uL)、O. 19uL的RNA抑制劑，共5. 84uL，每個(gè)反應(yīng)體系中加入9. 16uLRNA，總反應(yīng)體系為15uL。該方法的反應(yīng)條件為16° C反應(yīng)30分鐘，42° C反應(yīng)30分鐘，最后85° C孵育5分鐘。(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:采用TaqMan探針?lè)ㄟM(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，具體操作參照ABI的流程，其中部分進(jìn)行調(diào)整，反應(yīng)體系包括0. 25本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種膀胱癌的血清miRNA生物標(biāo)志物，其特征在于，所述生物標(biāo)志物為miR？663b或/和miR？497。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張正東，王美林，石丹妮，儲(chǔ)海燕，馬蘭，仝娜，吳冬梅，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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